sechenovSechenov Medical JournalСеченовский вестник2218-73322658-3348Сеченовский Университет10.47093/2218-7332.2022.338.06sechenov-423Research ArticleBIOMEDICINEБИОМЕДИЦИНАLifetime imaging of the discrete nanophosphors in biological systemsВизуализация дискретных нанофосфоров в биологических системах с учетом времени жизни флуоресценцииhttps://orcid.org/0000-0002-4490-4867ЗвягинцевА. О.ZvyagintcevA. O.

Звягинцев Артём Олегович, студент-стажер

Ленинский проспект, д. 59, г. Москва, 119333

Artyom O. Zviagintcev, student intern

59, Leninsky Prospekt, Moscow, 119333

https://orcid.org/0000-0003-0333-5095ЮдинцевА. В.YudintsevA. V.

Юдинцев Андрей Владимирович, канд. физ.-мат. наук, доцент, преподаватель кафедры биофизики Института биологии и биомедицины

пр. Гагарина, д. 23, корп. 2, Нижний Новгород, 603022

Andrey V. Yudintsev, Cand. of Sci. (Phys. and Math.), Associate Professor, Lecturer of the Department of Biophysics, Institute of Biology and Biomedicine

23, bld. 2, Prospekt Gagarina, Nizhny Novgorod, 603022

https://orcid.org/0000-0003-2852-2102МалекиА.MalekiA.

Малеки Алиреза, аспирант-исследователь факультета физики и астрономии

Балаклавская дорога, Норт-Райд, Новый Южный Уэльс, Сидней, 2109

Alireza Maleki, Postdoctoral Research Fellow, Department of Physics and Astronomy

Balaclava Road, North Ryde NSW 2109, Sydney

https://orcid.org/0000-0002-3726-5577ВоденеевВ. А.VodeneevV. A.

Воденеев Владимир Анатольевич, д-р биол. наук, доцент, заведующий кафедрой биофизики Института биологии и биомедицины

пр. Гагарина, д. 23, корп. 2, Нижний Новгород, 603022

Vladimir A. Vodeneev, Dr. of Sci. (Biology), Associate Professor, Head of the Department of Biophysics, Institute of Biology and Biomedicine

23, bld. 2, Prospekt Gagarina, Nizhny Novgorod, 603022

https://orcid.org/0000-0001-8799-2257ЗвягинА. В.ZvyaginA. V.

Звягин Андрей Васильевич, д-р физ.-мат. наук, Институт биологии и биомедицины; группа биомедицинской физики, руководитель факультета науки и техники Университета Маккуори

пр. Гагарина, д. 23, корп. 2, Нижний Новгород, 603022, Россия

Балаклавская дорога, Норт-Райд, Новый Южный Уэльс, Сидней, 2109, Австралия

Тел.: +7 (909) 924 91 16

Andrei V. Zvyagin, Dr. of Sci. (Physics and Mathematics), Institute of Biology and Biomedicine; Biomedical Physics Group, Head Faculty of Science and Engineering, Macquarie University

23, bld. 2, Prospekt Gagarina, Nizhny Novgorod, 603022, Russia

Balaclava Road, North Ryde NSW 2109, Sydney, Australia

Tel.: +7 (909) 924 91

andrei.zvyagin@mq.edu.auФНИЦ «Кристаллография и фотоника» Российской академии наукРоссияFederal Scientific Research Centre “Crystallography and Photonics” of Russian Academy of SciencesRussian FederationФГАУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» (ННГУ)РоссияLobachevsky Nizhny Novgorod State UniversityRussian FederationУниверситет МаккуориАвстралияMacquarie UniversityAustraliaФГАУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» (ННГУ); Университет МаккуориАвстралияLobachevsky Nizhny Novgorod State University; Macquarie UniversityAustralia2022251020211314354Copyright © Zvyagintcev A.O., Yudintsev A.V., Maleki A., Vodeneev V.A., Zvyagin A.V., 20212021Звягинцев А.О., Юдинцев А.В., Малеки А., Воденеев В.А., Звягин А.В.Zvyagintcev A.O., Yudintsev A.V., Maleki A., Vodeneev V.A., Zvyagin A.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.sechenovmedj.com/jour/article/view/423

The aim. Demonstrate a novel modality of laser-scanning multiphoton microscopy suitable for rapid acquisition of images of samples labelled with phosphorescent materials characterised by long emission lifetime measured in microseconds. The reported microscopy represents an advancement over the existing laser-scanning modalities, where the acquisition of images of phosphorescent materials takes unpractically long time.Materials and methods. The reported method is based on rapid scanning of the focussed excitation beam across a sample while continuously recording the photoluminescent (PL) signal. The resultant images of discrete phosphorescent nanoparticles appeared blurred. The diffraction-limited image was reconstructed by using a deconvolution algorithm, where the PL lifetime was the key input parameter. To test the method, two types of upconversion nanoparticles (UCNP) were synthesised, NaYF4:Yb3+:Er3+/NaYF4 (E-UCNP), β-NaYF4:Yb3+, Tm3+/NaYF4 (T-UCNP) and used to test a possibility of demultiplexing the two types of UCNPs ex vivo taken up in the mouse liver.Results. The resultant images of E-UCNP, T-UCNP on the background of the liver were fully reconstructed and exhibited the enhanced signal-to-noise ratio. Besides, the method allowed rapid (at the scale of seconds) acquisition of the UCNP PL lifetime and clear discrimination of the two types of UCNPs.Conclusion. We demonstrated a new approach for rapid PL image acquisition of samples containing PL materials, such as biological specimens labelled with discrete UCNPs. Blurred images were shown to be reconstructed at the post-processing stage by applying a deconvolution procedure. This enabled demonstration of multiplexing/demultiplexing using lifetime imaging mode, where the lifetime was engineered by the UCNP synthesis and reconstructed during multiphoton image acquisition using the deconvolution algorithm. The power of this method was demonstrated by the identification of two types of UCNPs accumulated in the liver of a laboratory animal. We believe that the demonstrated method can be useful for rapid lifetime imaging where several molecular specific labelling agents are required.

Цель. Продемонстрировать новый метод лазерной сканирующей многофотонной микроскопии, подходящий для быстрого получения изображений образцов, меченных фосфоресцирующими материалами, характеризующихся длительным временем жизни излучения, измеряемым в микросекундах. Представленная микроскопия представляет собой прогресс по сравнению с существующими методами лазерного сканирования, в которых получение изображений фосфоресцирующих материалов занимает непрактично долгое время.Материал и методы. Описанный метод основан на быстром сканировании сфокусированного луча возбуждения по образцу при непрерывной регистрации фотолюминесцентного (PL) сигнала. Полученные изображения дискретных фосфоресцирующих наночастиц выглядели размытыми. Изображение с дифракционным разрешением было восстановлено с использованием алгоритма деконволюции, где время жизни PL было ключевым входным параметром. Для тестирования метода были синтезированы два типа апконверсионных частиц (UCNP): NaYF4:Yb3+:Er3+/ NaYF4 (E-UCNP), β-NaYF4:Yb3+,Tm3+/NaYF4 (T-UCNP) и использованы для проверки возможности демультиплексирования двух типов UCNP ex vivo, доставленных в печень лабораторной мыши.Результаты. Полученные изображения E-UCNP, T-UCNP на фоне печени были полностью реконструированы и показали улучшенное отношение сигнал/шум. Кроме того, метод позволял быстро (в масштабе секунд) получать время жизни PL UCNP и четко различать два типа UCNP.Заключение. Мы продемонстрировали новый подход для быстрого получения изображений PL-образцов, содержащих флуоресцирующие вещества, например биологических образцов, меченных дискретными UCNP. Было показано, что размытые изображения восстанавливаются на этапе постобработки путем применения процедуры деконволюции. Это позволило продемонстрировать мультиплексирование/демультиплексирование в режиме визуализации времени жизни, где время жизни определялось синтезом UCNP и восстанавливалось во время получения многофотонного изображения с помощью алгоритма деконволюции. Возможности этого метода были продемонстрированы на примере идентификации двух типов UCNP, накопленных в печени лабораторного животного. Мы считаем, что продемонстрированный метод может быть полезен для быстрой прижизненной визуализации, когда требуется несколько молекулярно-специфических меченых агентов.

биофотоникаприжизненная визуализацияфосфорсодержащие материалыфотолюминесценция наночастиц с восходящей конверсиеймногофотонная микроскопияbiophotonicslifetime imagingphosphorous materialsupconversion nanoparticles photoluminescencemultiphoton microscopyАвторы выражают благодарность за финансовую поддержку Российскому фонду фундаментальных исследований (РФФИ), грант № 20-04-00182.The authors wish to acknowledge financial support from the Russian Foundation of Basic Research (RFBR), grant No 20-04-00182.ReferencesMoerner W.E. New directions in single-molecule imaging and analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Jul 31; 104 (31): 12596– 602. https://doi.org/10.1073/pnas.0610081104. Epub 2007 Jul 30. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Sep 25; 104 (39): 15584. PMID: 17664434.Moerner W.E. New directions in single-molecule imaging and analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Jul 31; 104 (31): 12596– 602. https://doi.org/10.1073/pnas.0610081104. Epub 2007 Jul 30. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Sep 25; 104 (39): 15584. PMID: 17664434.Gómez D.E., van Embden J., Jasieniak J., et al. Blinking and surface chemistry of single CdSe nanocrystals. Small. 2006 Feb; 2(2): 204–8. https://doi.org/10.1002/smll.200500204. PMID: 17193021.Gómez D.E., van Embden J., Jasieniak J., et al. Blinking and surface chemistry of single CdSe nanocrystals. Small. 2006 Feb; 2(2): 204–8. https://doi.org/10.1002/smll.200500204. PMID: 17193021.Altman R.B., Terry D.S., Zhou Z., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 2011 Nov 13; 9(1): 68–71. https://doi.org/10.1038/nmeth.1774. PMID: 22081126.Altman R.B., Terry D.S., Zhou Z., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 2011 Nov 13; 9(1): 68–71. https://doi.org/10.1038/nmeth.1774. PMID: 22081126.Hell S.W. Far-field optical nanoscopy. Science. 2007 May 25; 316 (5828): 1153–8. https://doi.org/10.1126/science.1137395. PMID: 17525330.Hell S.W. Far-field optical nanoscopy. Science. 2007 May 25; 316 (5828): 1153–8. https://doi.org/10.1126/science.1137395. PMID: 17525330.Sreenivasan V.K., Zvyagin A.V., Goldys E.M. Luminescent nanoparticles and their applications in the life sciences. J Phys Condens Matter. 2013 May 15; 25(19): 194101. https://doi.org/10.1088/09538984/25/19/194101. Epub 2013 Apr 24. PMID: 23611923.Sreenivasan V.K., Zvyagin A.V., Goldys E.M. Luminescent nanoparticles and their applications in the life sciences. J Phys Condens Matter. 2013 May 15; 25(19): 194101. https://doi.org/10.1088/09538984/25/19/194101. Epub 2013 Apr 24. PMID: 23611923.Edmonds A.M., Sobhan M.A., Sreenivasan V.K., et al. Nano-ruby: a promising fluorescent probe for background-free cellular imaging. Particle & Particle Systems Characterization. 2013; 30(6): 506–13. https://doi.org/10.1002/ppsc.201200112.Edmonds A.M., Sobhan M.A., Sreenivasan V.K., et al. Nano-ruby: a promising fluorescent probe for background-free cellular imaging. Particle & Particle Systems Characterization. 2013; 30(6): 506–13. https://doi.org/10.1002/ppsc.201200112.Yu S.J., Kang M.W., Chang H.C., et al. Bright fluorescent nanodiamonds: no photobleaching and low cytotoxicity. J Am Chem Soc. 2005 Dec 21; 127(50): 17604–5. https://doi.org/10.1021/ja0567081. PMID: 16351080.Yu S.J., Kang M.W., Chang H.C., et al. Bright fluorescent nanodiamonds: no photobleaching and low cytotoxicity. J Am Chem Soc. 2005 Dec 21; 127(50): 17604–5. https://doi.org/10.1021/ja0567081. PMID: 16351080.Yuan J., Wang G. Lanthanide-based luminescence probes and time-resolved luminescence bioassays. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2006; 25(5): 490–500. https://doi.org/10.1016/j.trac.2005.11.013.Yuan J., Wang G. Lanthanide-based luminescence probes and time-resolved luminescence bioassays. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2006; 25(5): 490–500. https://doi.org/10.1016/j.trac.2005.11.013.Nadort A., Sreenivasan V.K., Song Z., et al. Quantitative imaging of single upconversion nanoparticles in biological tissue. PLoS One. 2013 May 14; 8(5): e63292. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063292. PMID: 23691012.Nadort A., Sreenivasan V.K., Song Z., et al. Quantitative imaging of single upconversion nanoparticles in biological tissue. PLoS One. 2013 May 14; 8(5): e63292. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063292. PMID: 23691012.Zhan Q., He S., Qian J., et al. Optimization of optical excitation of upconversion nanoparticles for rapid microscopy and deeper tissue imaging with higher quantum yield. Theranostics. 2013. Mar 23; 3(5): 306–16. https://doi.org/10.7150/thno.6007. PMID: 23650478.Zhan Q., He S., Qian J., et al. Optimization of optical excitation of upconversion nanoparticles for rapid microscopy and deeper tissue imaging with higher quantum yield. Theranostics. 2013. Mar 23; 3(5): 306–16. https://doi.org/10.7150/thno.6007. PMID: 23650478.Wu S., Han G., Milliron D.J., et al. Non-blinking and photostable upconverted luminescence from single lanthanide-doped nanocrystals. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jul 7; 106(27): 10917–21. https://doi.org/10.1073/pnas.0904792106. Epub 2009 Jun 18. PMID: 19541601.Wu S., Han G., Milliron D.J., et al. Non-blinking and photostable upconverted luminescence from single lanthanide-doped nanocrystals. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jul 7; 106(27): 10917–21. https://doi.org/10.1073/pnas.0904792106. Epub 2009 Jun 18. PMID: 19541601.Gainer C.F., Utzinger U., Romanowski M. Scanning two-photon microscopy with upconverting lanthanide nanoparticles via Richardson-Lucy deconvolution. J Biomed Opt. 2012 Jul; 17(7): 076003. https://doi.org/10.1117/1.JBO.17.7.076003. PMID: 22894486.Gainer C.F., Utzinger U., Romanowski M. Scanning two-photon microscopy with upconverting lanthanide nanoparticles via Richardson-Lucy deconvolution. J Biomed Opt. 2012 Jul; 17(7): 076003. https://doi.org/10.1117/1.JBO.17.7.076003. PMID: 22894486.Pominova D.V., Ryabova A.V., Grachev P.V., et al. Upconversion microparticles as time-resolved luminescent probes for multiphoton microscopy: desired signal extraction from the streaking effect. J Biomed Opt. 2016 Sep 1; 21(9): 96002. https://doi.org/10.1117/1.JBO.21.9.096002. PMID: 27604561.Pominova D.V., Ryabova A.V., Grachev P.V., et al. Upconversion microparticles as time-resolved luminescent probes for multiphoton microscopy: desired signal extraction from the streaking effect. J Biomed Opt. 2016 Sep 1; 21(9): 96002. https://doi.org/10.1117/1.JBO.21.9.096002. PMID: 27604561.Kostyuk A.B., Guryev E.L., Vorotnov A.D., et al. Real-Time Tracking of Yb3+, Tm3+ Doped NaYF4 Nanoparticles in Living Cancer Cells. Sovremennye tehnologii v medicine 2018; 10(1): 57–63. http://doi.org/10.17691/stm2018.10.1.07.Kostyuk A.B., Guryev E.L., Vorotnov A.D., et al. Real-Time Tracking of Yb3+, Tm3+ Doped NaYF4 Nanoparticles in Living Cancer Cells. Sovremennye tehnologii v medicine 2018; 10(1): 57–63. http://doi.org/10.17691/stm2018.10.1.07.Kostyuk A.B., Vorotnov A.D., Ivanov A.V., et al. Resolution and contrast enhancement of laser-scanning multiphoton microscopy using thulium-doped upconversion nanoparticles. Nano Res. 2019; 12: 2933–40. https://doi.org/10.1007/s12274-019-2527-0.Kostyuk A.B., Vorotnov A.D., Ivanov A.V., et al. Resolution and contrast enhancement of laser-scanning multiphoton microscopy using thulium-doped upconversion nanoparticles. Nano Res. 2019; 12: 2933–40. https://doi.org/10.1007/s12274-019-2527-0.Fan Y., Wang P., Lu Y., et al. Lifetime-engineered NIR-II nanoparticles unlock multiplexed in vivo imaging. Nat Nanotechnol. 2018 Oct; 13(10): 941–6. https://doi.org/10.1038/s41565-018-0221-0. Epub 2018 Aug 6. PMID: 30082923.Fan Y., Wang P., Lu Y., et al. Lifetime-engineered NIR-II nanoparticles unlock multiplexed in vivo imaging. Nat Nanotechnol. 2018 Oct; 13(10): 941–6. https://doi.org/10.1038/s41565-018-0221-0. Epub 2018 Aug 6. PMID: 30082923.Johnson N.J., Korinek A., Dong C., van Veggel F.C. Self-focusing by Ostwald ripening: a strategy for layer-by-layer epitaxial growth on upconverting nanocrystals. J Am Chem Soc. 2012 Jul 11; 134(27): 11068–71. https://doi.org/10.1021/ja302717u. Epub 2012 Jun 26. PMID: 22734596.Johnson N.J., Korinek A., Dong C., van Veggel F.C. Self-focusing by Ostwald ripening: a strategy for layer-by-layer epitaxial growth on upconverting nanocrystals. J Am Chem Soc. 2012 Jul 11; 134(27): 11068–71. https://doi.org/10.1021/ja302717u. Epub 2012 Jun 26. PMID: 22734596.Rocheva V.V., Koroleva A.V., Savelyev A.G., et al. Highresolution 3D photopolymerization assisted by upconversion nanoparticles for rapid prototyping applications. Sci Rep. 2018 Feb 26; 8(1): 3663. https://doi.org/10.1038/s41598-018-217930. PMID: 29483519.Rocheva V.V., Koroleva A.V., Savelyev A.G., et al. Highresolution 3D photopolymerization assisted by upconversion nanoparticles for rapid prototyping applications. Sci Rep. 2018 Feb 26; 8(1): 3663. https://doi.org/10.1038/s41598-018-217930. PMID: 29483519.Hehlen M., Kuditcher A., Lenef A., et al. Nonradiative dynamics of avalanche upconversion in Tm: LiYF4. Physical Review B. 2000; 61(2): 1116. https://doi.org/10.1103/PhysRevB.61.1116Hehlen M., Kuditcher A., Lenef A., et al. Nonradiative dynamics of avalanche upconversion in Tm: LiYF4. Physical Review B. 2000; 61(2): 1116. https://doi.org/10.1103/PhysRevB.61.1116Zhao J., Jin D., Schartner E.P., et al. Single-nanocrystal sensitivity achieved by enhanced upconversion luminescence. Nat Nanotechnol. 2013 Oct; 8(10): 729–734. https://doi.org/10.1038/nnano.2013.171. Epub 2013 Sep 1. PMID: 23995455.Zhao J., Jin D., Schartner E.P., et al. Single-nanocrystal sensitivity achieved by enhanced upconversion luminescence. Nat Nanotechnol. 2013 Oct; 8(10): 729–734. https://doi.org/10.1038/nnano.2013.171. Epub 2013 Sep 1. PMID: 23995455.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.