Одной из наиболее острых и социально значимых задач современной реабилитационной медицины остается функциональное восстановление структурных дефектов спинного мозга различного генеза [1][2]. Согласно данным W. Ding и соавт. [3] заболеваемость и бремя травм спинного мозга (ТСМ) увеличились за последние 30 лет; в 2019 г. во всем мире частота ТСМ составила 900 000, распространенность – 20 600 000, общее число лет, прожитых с инвалидностью, оценено в 6,2 года. Мужчины и пожилые люди подвержены ТСМ в большей степени, чем женщины и молодые люди [3].

В экспериментальных моделях установлено, что повреждение спинного мозга после травматического воздействия развивается не только в эпицентре травмы, но и в удаленных участках спинного мозга, что может затруднять последующую реабилитацию [4]. ТСМ подвержены лица трудоспособного возраста, у более чем 50% пациентов не происходит восстановления функции спинного мозга после травматического воздействия, что влечет за собой необходимость ежедневного ухода за ними. Подобные травмы представляют значимую медико-социальную проблему [5]. На сегодня постоянно принимаются попытки разработать эффективные методы лечения и реабилитации пациентов с ТСМ [2][5].

Современные подходы к терапии ТСМ сосредоточены прежде всего на восстановлении двигательной функции и мало касаются целенаправленной коррекции инволюционных процессов, происходящих в нейронах спинного мозга [6]. Во многом это связано с патофизиологической гетерогенностью ТСМ, особенностями вторичного повреждения спинного мозга после действия травмирующего фактора и ограниченным количеством биохимических маркеров ТСМ, используемых на доклиническом этапе изучения эффективности тестируемого подхода к лечению и/или реабилитации таких пациентов [7].

Патогенез ТСМ опосредуется первичными и вторичными механизмами повреждения. Так, первичное повреждение связано с действием травмирующего фактора, в результате чего наблюдается смещение позвонков или переломы, а также разрушение паренхимы нервов, нарушение аксональной сети, кровоизлияние и разрыв глиальной мембраны [8]. Фаза вторичного повреждения отражает многообразие патологических процессов, вызванных первичным повреждением, и длится несколько недель. На данном этапе ТСМ отмечаются следующие клеточные реакции: активация апоптоза, эксайтотоксичность, нарушение ионной регуляции, повышение продукции цитокинов и окислительный стресс, лежащие в основе тканевых изменений (ишемия, повреждение сосудов, отек). Следует отметить, что процессы первичного и вторичного повреждений не являются изолированными, они протекают практически одновременно и имеют множество точек соприкосновения. Например, разрыв сосудов вызывает кровоизлияние с последующей инфильтрацией моноцитов, нейтрофилов, Т- и В-лимфоцитов и макрофагов в ткани позвоночника, что сопровождается высвобождением провоспалительных цитокинов: интерлейкина 1а, интерлейкина 1b, интерлейкина 6 (ИЛ-6) и фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α), которые вызывают нейровоспаление [9]. Изменение биомаркеров воспалительной реакции при ТСМ было изучено в некоторых работах.

D. Sabirov и соавт. оценивали изменение цитокинового профиля в сыворотке крови и спинном мозге животных с ТСМ и показали, что после ее моделирования высокие уровни цитокинов (CCL26, интерферон-γ, ИЛ-6) обнаруживаются как в ткани спинного мозга, так и в сыворотке крови, что свидетельствует о развитии системной воспалительной реакции. Стоит отметить, что данное исследование выполнено на одной модели ТСМ – контузионной [10]. Также повышенные уровни цитокинов в крови были обнаружены у пациентов с острой и подострой ТСМ [11]. Вышеперечисленное делает цитокины ценным прогностическим инструментом при проведении не только доклинических, но и клинических исследований [12].

Кроме того, B. Tong и соавт. установили, что одним из достоверных сывороточных маркеров, коррелировавшим с тяжестью течения ТСМ, является альбумин [13]. При ретроспективном анализе данных 591 пациента с ТСМ было показано, что сывороточный альбумин в значительной степени коррелировал с неврологическими исходами. Так, во временном отрезке 52 недели высокие концентрации сывороточного альбумина были сопряжены с высоким показателем двигательной активности нижних конечностей и достижением «выраженного неврологического восстановления» [13]. Также стоит отметить, что изменение концентрации сывороточного альбумина может являться маркером интенсивности воспалительного процесса, что отражено в работе A. Sheinenzon и соавт. [14].

В результате первичного и вторичного повреждения спинного мозга отмечается развитие не только нейровоспаления, но и других патофизиологических реакций. Первичным триггером окислительного стресса при ТСМ является увеличение концентрации Ca2+, который ингибирует митохондриальное дыхание, вызывает истощение энергии и нарушает ионный гомеостаз. Изменение функции Na+/K+ аденозинтрифосфатазы (АТФазы) повышает деполяризацию аксональных мембран и приводит к избыточному притоку Na+ в аксоны. Эта ионная дисрегуляция вызывает набухание, аксональный ацидоз, активацию фосфолипаз и повышенную генерацию активных форм кислорода (АФК) [15].

Высокие уровни АФК и активных форм азота запускают патологические реакции, включая перекисное окисление липидов. Оно протекает в три этапа:

Поскольку свободные радикалы недолговечны и трудно оценить их содержание, измеряют концентрацию конечного продукта окисления липидов и белков в реакции с тиобарбитуровой кислотой (их называют ТБК-продуктами) – например, малонового диальдегида. Также важно оценить активность эндогенной антиоксидантной защиты, действие которой направлено на уменьшение цитотоксичности АФК. Антиперекисная защита клетки представлена антиоксидантными ферментами и эндогенными скэвенджерами радикалов, которые демонстрируют разную активность детоксикации АФК. Наиболее выраженным потенциалом обладают антиоксидантные ферменты, например супероксиддисмутаза (СОД).

Таким образом, оценка изменения концентрации биомаркеров воспаления и окислительного стресса при ТСМ позволит в значительной степени спрогнозировать течение заболевания и его клинический исход. При этом особое значение приобретает изучение параметров, характеризующих ход воспалительных реакций и окислительного стресса как одних из основных патогенетических путей ТСМ.

Цель исследования: в условиях экспериментальной ТСМ различного генеза: контузионной, компрессионной, вызванной механической ламинэктомией и гемисекцией спинного мозга у крыс в сопоставимых условиях оценить изменение концентрации биомаркеров воспаления и окислительного стресса в сыворотке крови.

Исследование выполнено на 48 шестимесячных половозрелых крысах-самцах Wistar массой 240–260 г, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово», Ленинградская область. На время исследования животные размещались в контролируемых условиях вивария при температуре окружающего воздуха 22 ± 2 °С, относительной влажности 60 ± 5% и естественной смене суточного цикла. Доступ крыс к полнорационному корму и воде не ограничивали.

ТСМ моделировали у животных путем воздействия 7 различных травмирующих факторов на сегмент спинного мозга T10, выделяемый пальпацией, анестезия осуществлялась хлоралгидратом (350 мг/кг, внутрибрюшинно).

Для моделирования контузионной травмы использовали свободнопадающий груз разного веса (легкой L200 – 1,12 ньютона на квадратный сантиметр (Н/см²), умеренной L300 – 1,68 Н/см² и L350 – 1,96 Н/см²) при помощи установки, состоящей из штатива с закрепленным на ним цилиндром фиксированного диаметра 3 см и фиксирующей подставки под тело животного [17][18].

Гемисекцию спинного мозга воспроизводили путем терминального смещения позвонков (перелома позвоночника). Позвонок Т10 смещался относительно Т9 и Т11 путем приложения внешней механической силы (щипцы с контролем приложения силы, «Force», КНР), до аудиовизуального подтверждения перелома [17].

Для моделирования пневмоконтузии использовали давление углекислого газа (2 Н/см²) при помощи баллона со сжатым воздухом, снабженным редуктором и соплом диаметром 7 мм [19].

Механическую ламинэктомию проводили при помощи механического бура, как описано V.S. Harikrishnan и соавт. [20]. Животным делали надрез кожи длиной около 2,5 см, осторожно отделяли паравертебральную мускулатуру. Остистый отросток позвонка удаляли. Буром Marathon («Marathon», Корея) с обеих сторон просверливали дорсальную пластинку, после чего на спинной мозг воздействовали актуатором с пружинной регулировкой приложенной силы 2 Н/см².

Компрессионную травму моделировали сжатием позвонка Т10 (сила 2 Н/см²) зажимом кровоостанавливающим Surgicon instr. («Surgicon instr», Пакистан) [21].

Количество животных в каждой из 7 экспериментальных групп равнялось 6 (n = 42). Сравнение анализируемых показателей осуществляли с группой интактного контроля (n = 6). После моделирования ТСМ крыс помещали в индивидуальные клетки под согревающей лампой до пробуждения, наблюдение за ними в первые сутки осуществляли непрерывно. Корм и чистая водопроводная вода подавались ad libitum и контролировались ежедневно. В случае снижения потребления корма и воды крысой через 3–5 дней после ТСМ ей вводили раствор Рингера (1 мл/100 г подкожно). С целью предотвращения задержки мочи и облегчения процесса мочеиспускания мочевой пузырь дважды в день вручную массировали, для чего осторожно пальпировали живот, определяли местонахождение мочевого пузыря, затем легко надавливали на него по направлению «сверху вниз», пока мочевой пузырь не опорожнялся. Гематурии в ходе эксперимента не зафиксировано, в связи с чем антибиотикотерапию не проводили.

ТСМ воспроизводили однократно. Время экспозиции до забора биоматериала составило 28 дней, что отражает наиболее выраженные изменения, опосредованные М1 фенотипом макрофагов, протекающие в условиях хронического воспаления после перенесенной травмы, как установлено K.A. Kigerl и соавт. [22].

По истечении указанного времени у наркотизированных хлоралгидратом (350 мг/кг, внутрибрюшинно) животных из брюшной части аорты осуществляли забор крови в вакуумные пробирки с этилендиаминтетраацетатом. Для забора крови вскрывали брюшную полость, отодвигали кишечник с содержимым, обнажая нижнюю полую вену и брюшную часть аорты, которые отделяли от прилегающих тканей, в аорту вводили шприц объем 5 мл c иглой 22 G («SF Medical», КНР), предварительно промытый этилендиаминтетраацетатом и отбирали кровь в объеме 3,0 мл. Далее животных выводили из эксперимента путем цервикальной дислокации.

Цельную кровь центрифугировали в режиме 1000 g 15 минут с последующим получением сыворотки и определением концентрации маркеров, характеризующих интенсивность реакций провоспаления: ФНО-α, ИЛ-6, альбумин, а также маркеров окислительного стресса: СОД, активных продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП).

Концентрацию ФНО-α и ИЛ-6 оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием видоспецифичных наборов реактивов (CloudClone corp., США) согласно инструкции производителя. Аналитический сигнал регистрировали на микропланшетном ридере Infinite F50 (Tecan, Австрия). Содержание альбумина определяли с применением системы автоматического биохимического анализатора BS-380 (Mindray, КНР) и стандартного набора для оценки концентрации альбумина в сыворотке крови (DiaSyS, Германия).

Концентрацию ТБК-АП оценивали в сыворотке спектрофотометрическим методом в реакции конденсации с 2-тиобарбитуровой кислотой, в ходе которой образующийся окрашенный комплекс имеет максимум поглощения при 532 нм. При этом окраска раствора пропорциональна концентрации ТБК-АП. Количество ТБК-АП рассчитывали по величине молярного коэффициента экстинкции малонового диальдегида (1,56×105 лмоль-1см-1), полученные результаты выражали в мкмоль/мг белка. Содержание белка определяли по методу Бредфорда [23][24].

Активность СОД оценивали ксантин-ксантиноксидазным методом, основанным на реакции дисмутации супероксидного радикала, образующегося в ходе окисления ксантина и восстановления 2-(4-йодофенил)-3-(4-нитрофенол)-5-фенилтетразолия хлорида. Среда инкубации содержала: ксантин 0,05 ммоль/л; 2-(4-йодофенил)-3-(4-нитрофенол)-5-фенилтетразолия хлорид 0,025 ммоль/л; этилендиаминтетраацетат 0,94 ммоль/л, ксантиноксидаза 80 ед/л, CAPS – 40 ммоль/л. Оптическую плотность смеси регистрировали при 505 нм. Активность СОД выражали в ед/л. Содержание белка определяли по методу Бредфорда [24][25].

Полученные данные подвергались тесту на нормальность распределения согласно критерию Шапиро – Уилка. Для сравнения групповых средних применяли параметрические методы: ANOVA с апостериорным (post hoc) тестом Тьюки, критерий Даннета при сравнении каждой из экспериментальных групп с контрольной. Отличия считались статистически значимыми при p < 0,05. Результаты экспериментов обрабатывались с помощью программы Statistica 13.0 (TIBCO, США).

При моделировании различных вариантов ТСМ по сравнению с интактным контролем отмечено статистически значимое повышение концентрации ФНО-α в сыворотке крови (рис. 1). При этом в случае контузионной травмы (L200; L350; L300) содержание ФНО-α было выше такового у интактных животных на 142,9% (p < 0,05); 133,9% (p < 0,05); 115,5% (p < 0,05) соответственно. Пневмоконтузия и механическая ламинэктомия приводили к повышению концентрации ФНО-α по отношению к группе контроля на 151,8% (p < 0,05) и 147% (p < 0,05) соответственно. Наиболее выраженные изменения ФНО-α наблюдались в случае моделирования компрессионной травмы и гемисекции: содержание ФНО-α было выше в сравнении с интактным контролем на 234,5% (p < 0,05) и 229,2% (p < 0,05) соответственно. При воспроизведении компрессионной травмы и частичной гемисекции концентрация ФНО-α была статистически значимо выше, чем при других типах ТСМ.

Аналогично изменялась концентрация ИЛ-6. Так, при моделировании контузионной травмы (L200; L350; L300), пневмоконтузии, компрессионной травмы, механической ламинэктомии и частичной гемисекции содержание ИЛ-6 было статистически значимо выше (p < 0,05) показателей группы интактного контроля на 54,2; 72,9; 55,9; 54,2; 62,7; 49,2 и 89,8% соответственно.

Концентрация альбумина в сыворотке крови при моделировании ТСМ была ниже, чем у интактных животных: в группе контузионной травмы (L200; L350; L300) на 24,2% (p < 0,05); 23,5% (p < 0,05); 24,2 % (p < 0,05) соответственно; пневмоконтузии на 36,3% (p < 0,05), компрессионной травмы на 25,8% (p < 0,05), механической ламинэктомии – 24,2% (p < 0,05) и частичной гемисекции – 41,9% (p < 0,05). В группе частичной гемисекции концентрация альбумина в сыворотке крови крыс была ниже, чем у животных, которым ТСМ моделировали путем контузии, компрессии и механической ламинэктомии (p < 0,05).

Нами продемонстрировано, что при моделировании различных вариантов ТСМ у крыс в сыворотке крови отмечается активация окислительного стресса (табл.). Выражается это в виде повышения концентрации ТБК-АП: при контузионной травме (L200; L350; L300) на 103,2% (p < 0,05); 106,5% (p < 0,05); 106,5% (p < 0,05) соответственно, при пневмоконтузии на 135,5% (p < 0,05), компрессионной травме на 103,2% (p < 0,05), механической ламинэктомии на 116,1% (p < 0,05) и частичной гемисекции на 109,7% (p < 0,05). В то время как активность СОД снижается: при контузионной травме (L200; L350; L300) на 30,9% (p < 0,05); 28,3% (p < 0,05); 28,6% (p < 0,05) соответственно; при пневмоконтузии на 26,9% (p < 0,05), компрессионной травме на 29% (p < 0,05), механической ламинэктомии на 26,3% (p < 0,05) и частичной гемисекции на 31,7% (p < 0,05).

Моделирование ТСМ в условиях in vivo эксперимента представляет собой трудоемкий процесс, и зачастую перед исследователями встает выбор релевантной модели ТСМ и оцениваемых параметров, позволяющих с высоким уровнем достоверности определить тяжесть ТСМ и вероятный клинический исход.

Одним из основных критериев оценки адекватности модели является выявление морфологических изменений (регенерация аксонов, миелинизация, васкуляризация, плотность глиального рубца, воспалительная реакция) в зоне повреждения, а также прилежащих проксимальных и дистальных областей с помощью гистологического изучения поперечных и сагиттальных срезов [3][26]. Кроме того, на релевантность доклинической модели ТСМ может указывать изменение биомаркеров, например реакций воспаления и окислительного стресса, определяемых как в спинномозговой жидкости, так и в сыворотке крови [27].

Проведенное исследование показало, что из оцениваемых вариантов моделирования ТСМ, а именно контузионной травмы (сила воздействия 1,12; 1,68; 1,96 Н/см²); пневмоконтузионной травмы (сила воздействия 2 Н/см²), компрессионной травмы (сила воздействия 2 Н/см²), травм, вызванных механической ламинэктомией, а также гемисекцией спинного мозга, наиболее выраженные изменения концентрации сывороточных маркеров воспаления наблюдаются при моделировании травмы, вызванной механической ламинэктомией и гемисекцией спинного мозга, что выражалось в более высоких показателях содержания ФНО-α в сыворотке крови крыс. В то же время на фоне всех экспериментальных вариантов ТСМ данной работы отмечены сопоставимые изменения концентрации ИЛ-6, альбумина и маркеров окислительного стресса: активности СОД и содержания ТБК-АП. Подобные различия в изменении концентрации маркеров воспаления и окислительного стресса, вероятно, опосредуются тяжестью повреждения спинного мозга, что отмечает в свой работе X. Hu и соавт. [28].

В то же время похожие результаты были получены M. Kayabaşe и соавт., которые при изучении нейропротективного действия обогащенного водородом физиологического раствора при ТСМ, вызванной ламинэктомией, продемонстрировали достоверное увеличение концентрации ФНО-α и ИЛ-6 в сыворотке крови участвовавших в эксперименте крыс [29]. В условиях ТСМ, вызванной гемисекцией спинного мозга, исследовательская группа W.M. Kung и соавт. продемонстрировала повышение экспрессии мРНК ФНО-α у нелеченых животных [30]. Развитие окислительного стресса в условиях ТСМ также неоднократно изучалось и, по данным M. Yu и соавт., отмечается практически во всех патогенетических вариантах ТСМ, независимо от этиологии и степени тяжести [31].

Данная работа выполнена на крысах-самцах, в дальнейшем необходимо оценить возможные гендерные различия. В исследовании не представлены результаты гистологического анализа, в перспективе необходимо изучить интенсивность реакций воспаления и окислительного стресса в разрезе иммуногистохимического анализа, позволяющего оценить зависимость наблюдаемых изменений от типа активных иммунных клеток.

Все использованные в данной работе экспериментальные модели ТСМ приводят к активации реакций воспаления и окислительного стресса. В случае анализа интенсивности липопероксидативных процессов изучаемые модели ТСМ демонстрируют сопоставимые данные. В то же время реакции воспаления были более выражены в случае моделирования компрессионной травмы и гемисекции, о чем свидетельствует повышенное содержание ФНО-α по сравнению с остальными вариантами травмы.

Д.И. Поздняков, В.В. Козлова, В.Ф. Репс разработали концепцию исследования, участвовали в проведении эксперимента. Д.И. Поздняков и В.Ф. Репс подготовили рукопись. В.В. Козлова провела статистическую обработку данных. Все авторы утвердили окончательную версию статьи.

Соответствие принципам этики. Исследование проведено с соблюдением положений Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей. Все манипуляции с животными проведены в соответствии с разрешением Локального этического комитета Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России (№ 15-11.04.2023).

Доступ к данным исследования. Данные, подтверждающие выводы этого исследования, можно получить у авторов по обоснованному запросу.

Данные и статистические методы, представленные в статье, прошли статистическое рецензирование редактором журнала – сертифицированным специалистом по биостатистике.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки (собственные ресурсы).