Астроциты и клетки микроглии центральной нервной системы (ЦНС) в первую очередь подвергаются изменениям при воздействии проникающих через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и повреждающих структуру нервной ткани химических соединений [1][2]. В то же время изменения в астроцитах и клетках микроглии характерны для нейродегенеративных расстройств [1], нарушений памяти и обучения [3], старения [4].

Воздействия различных инфекционных и неинфекционных агентов на нервную ткань, приводящие к изменениям в популяциях макро- и микроглии, позволяют моделировать повреждение ЦНС и изучать его особенности. Исследования в этой области актуальны в связи с ростом нейродегенеративных заболеваний ЦНС и их влиянием на эпидемиологические и социально-экономические показатели благополучия населения, что побуждает искать терапевтические подходы и модели их апробации [5][6].

Отмечено, что внутрибрюшинное (в/б) введение грызунам несептических доз бактериального липополисахарида (ЛПС) может быть использовано для оценки повреждения нейроглии [7]. После первого введения ЛПС астроциты и клетки микроглии реагируют выделением различных цитокинов, а спустя несколько суток в них становятся заметны структурные изменения. Это продемонстрировано при исследовании морфологии астроцитов и клеток микроглии в префронтальной коре больших полушарий головного мозга и гиппокампе после введения мышам высоких доз ЛПС однократно или невысоких доз ЛПС на протяжении нескольких дней [2].

В качестве направлений дальнейших исследований в ряде обзоров было предложено изучить изменения в астроцитах и микроглии при введении мышам несептических доз ЛПС в течение нескольких дней. Эти клетки цингулярной и ретросплениальной коры больших полушарий первыми затрагиваются при возрастных заболеваниях ЦНС, нарушениях памяти и аффекта [8][9].

Одним из ключевых маркеров для оценки состояния астроцитов является глиальный фибриллярный кислый белок (glial fibrillary acidic protein, GFAP). Он входит в состав промежуточных филаментов в астроцитах и обладает высокой специфичностью к ним. Количество GFAP в цитоплазме клеток глии увеличивается при повреждении нервной ткани и при старении [10]. Применение другого маркера, ионизированной кальций-связывающей адаптерной молекулы 1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1, Iba1), позволяет выявить клетки микроглии в ЦНС [11]. Основная роль этого белка состоит в стабильном связывании нитей актина в пучки, поэтому его экспрессия в клетке нарастает при переходе микроглии из покоящегося состояния в активированное [12]. Следовательно, изменения экспрессии GFAP и Iba1 служат наиболее приемлемым показателем воздействия ЛПС на клетки астро- и микроглии [13].

Цель исследования: изучить экспрессию GFAP и Iba1 в нейроглии цингулярной и ретросплениальной коры больших полушарий головного мозга у мышей на 5-е сутки после в/б введения бактериального ЛПС в дозе, не вызывающей воспаление нервной ткани.

Исследование выполнено на самках мышей линии С57BL/6 (n = 10), полученных из филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России. Возраст животных на начало эксперимента составлял 90 ± 3 суток, средняя масса 28,0 ± 3,2 г. Выбор пола грызунов обусловлен данными литературы о более стойкой экспрессии толл-подобного рецептора 4 в нейроглии у самок, тогда как именно он опосредует ЛПС-сигнализацию [14]. Возраст мышей удовлетворяет двум принципам: избежать связанной со старением перестройки нервной ткани и не допустить искажения, которое у более молодых особей возможно из-за незавершенного прунинга и образования синапсов. Минимальное количество животных для разработки модели отобрано согласно концепции 3R и стандартным правилам для дизайна экспериментов на грызунах [15].

Мышей содержали в лабораторном виварии в условиях постоянной комнатной температуры 20–22 °C и относительной влажности 50–60% с доступом к чистой воде и гранулированному корму ad libitum. Перед экспериментом животные прошли двухнедельный карантин и осмотр ветеринарным врачом. После этого грызунов рандомизировали методом случайных чисел на две равные группы и с этого момента содержали мышей каждой группы в отдельной клетке.

Животным группы 1 (n = 5) вводили 0,1 мл физиологического раствора (NaCl 0,9%) в/б, а мышам группы 2 (n = 5) ЛПС 1 мг/кг E. coli O111:B4 (партия 091M4031V, Sigma-Aldrich, США), разведенного физиологическим раствором до 0,1 мл. По данным литературы, экспрессия GFAP и Iba1 нарастает после введения мышам ЛПС 0,5–2 мг/кг в/б [2][7]. На основе анализа этих методик для эксперимента выбрана усредненная доза ЛПС в 1 мг/кг. Инъекции выполняли в одно и то же время суток в течение последовательных 4 дней согласно общепринятой методике [16]. Выведение животных из эксперимента осуществляли путем декапитации с предварительным введением 5 мг/кг ксилазина гидрохлорида (Interchemie, Нидерланды) и 40 мг/кг тилетамина/золазепама (Vibrac, Франция) (рис. 1).

Забор органов и тканей осуществляли по следующей методике. Ножницами разрезали кожу на уровне затылка и делали продольный разрез по направлению к носу. После отделения кожи рассекали череп поперечно на уровне носовой перегородки и далее продолжали разрезать затылочную и теменную кости так, чтобы ножницы не слишком глубоко проникали в носовую полость. Удалив череп, извлекали головной мозг. Фиксацию проводили в 10% нейтральном забуференном формалине (ООО «ЭргоПродакшн», Россия). После этого выполняли стандартную проводку через изопропиловый спирт возрастающей концентрации и заливку в парафиновые блоки. На ручном ротационном микротоме HM 325 (Thermo Fisher Scientific, США) изготавливали фронтальные срезы головного мозга толщиной 5 мкм, переносили на предметные стекла с адгезивным покрытием силан (ООО «Минимед», Россия) и подсушивали в термостате при температуре 37 °C в течение 25 суток.

Перед окрашиванием срезы головного мозга выдерживали в депарафинизирующем и демаскировочном фосфатном растворе (партия XF05RT4N9592) (Elabscience, США), разведенном дистиллированной водой 1:20, с нагревом в течение 20 мин. После этого промывали каждый срез фосфатно-солевым буферным раствором (phosphate-buffered saline, PBS) (ООО «ЭКО-СЕРВИС», Россия) трижды по 2 мин и во избежание собственной пероксидазной активности тканей инкубировали с 3% перекисью водорода в течение 20 мин. Далее, после вторичной промывки PBS трижды по 2 мин, наносили на срезы бычий сывороточный альбумин на 20 мин. После удаления альбумина препараты инкубировали с первичными моноклональными антителами к GFAP1 в разведении 1:500 и поликлональными антителами к Iba12 в разведении 1:200. Сразу же после этого каждый срез промывали PBS трижды по 2 мин и наносили вторичные поликлональные антитела кролика с пероксидазой хрена3, за чем следовала получасовая инкубация и промывка PBS раствором. В качестве хромогена использовали 3,3’-диаминобензидин (CDH, Индия), излишки которого смывали дистиллированной водой и докрашивали препараты гематоксилином Карацци (ГК «Биовитрум», Россия) с заключением в монтирующую среду.

Морфологические изменения изучали при помощи микроскопа Axio Imager.A1 с камерой Axiocam 305 color и программного обеспечения Zen 3.3 (все – производство Zeiss, Германия). Гистологическую оценку нормальной цито- и миелоархитектоники проводили на серийных срезах изокортекса. На микрофотографиях больших полушарий определяли зоны цингулярной и ретросплениальной коры при помощи стереотаксического атласа G. Paxinos и K.B.J. Franklin [17]: для подсчета были отобраны 12 корональных срезов между уровнями брегмы -0,2 и -0,3 на каждую группу. Для подсчета макрофагов снимки, полученные при увеличении объектива ×40 и фотографировании камерой Axiocam 305 color, обрабатывали с помощью программного обеспечения с открытым кодом QuPath 0.5.0 (Queen’s University Belfast, Великобритания)4 [18] в режиме обнаружения 3,3’-диаминобензидин положительных структур в одном поле зрения.

Проведенное иммуногистохимическое (ИГХ) исследование показало неравномерное распределение белка Iba1 по цитоплазме клеток – обнаружены клетки как с множеством зон с Iba1-положительным окрашиванием, так и с единичными структурами. Поэтому в качестве показателя активации клеток микроглии интерпретировали участки Iba1-положительной цитоплазмы, а не сами клетки.

Маркер GFAP, напротив, распределялся в цитоплазме клеток равномерно, поэтому для количественной оценки его экспрессии учитывали число окрашенных клеток. Подсчет количества GFAP-положительных клеток производили в программном обеспечении Zen 3.3 по снимкам, сделанным при увеличении объектива ×10 и фотографировании камерой Axiocam 305 color, в одном поле зрения.

Несмотря на то что олигодендроциты также относятся к нейроглии, их оценка в рамках настоящей работы представляется нецелесообразной. Поскольку олигодендроциты не входят в состав ГЭБ, изменения их морфологии при воздействии несептических доз ЛПС маловероятны. Реакция олигодендроцитов показана у новорожденных животных при в/б введении ЛПС 1 мг/кг массы тела [19], а также у животных при прямом стереотаксическом введении ЛПС в структуры головного мозга [20] и при моделировании острого нарушения мозгового кровообращения [21].

Значения представлены в виде медианы и межквартильного размаха (25-й; 75-й процентили). Для межгруппового сравнения использовали U-критерий Манна – Уитни. Уровень статистической значимости в эксперименте принят как p < 0,05. Статистическую обработку данных выполняли при помощи программного обеспечения Microsoft Excel (Microsoft, США) и OriginPro (OriginLab, США).

При гистологическом исследовании срезов головного мозга у мышей обеих групп не выявлено повышенного кровенаполнения сосудов и кровоизлияний. Также ни в одной структуре головного мозга не отмечено периваскулярного отека или миграции лейкоцитов. ИГХ исследование выявило положительную реакцию на антитела к белкам GFAP и Iba1 на срезах коры больших полушарий головного мозга в обеих группах. Экспрессия маркеров GFAP и Iba1 показана на рисунке 2.

При подсчете количества клеток, экспрессирующих GFAP, в группе 1 выявлено 9,0 (4,3; 17,0), в группе 2 – 22,5 (8,0; 32,0). Различие между медианными значениями статистически значимо с величиной p = 0,0038 (рис. 3А).

Анализ участков цитоплазмы, экспрессирующих Iba1, выявил 128 (89,3; 165,5) Iba1-положительных участков цитоплазмы в поле зрения в группе 1 и 207,5 (154,8; 295,8) в группе 2 (рис. 3B). Различия между медианными значениями статистически значимы (p = 0,014).

Полученные результаты свидетельствуют о статистически значимом повышении экспрессии GFAP и Iba1 в цингулярной и ретросплениальной коре больших полушарий головного мозга у мышей после введения ЛПС 1 мг/кг/сутки в течение 4 дней.

Известно, что белок GFAP характерен для промежуточных филаментов в астроцитах [22], хотя его можно выявить не только в астроглии [23]. При гистологическом исследовании в описанном эксперименте увеличение экспрессии GFAP наблюдалось именно в астроцитах мышей экспериментальной группы.

Белок Iba1 характерен для популяций реактивных макрофагов, в том числе и в нейроглии [24]. Кроме того, Iba1 является маркером не только клеток микроглии, но и клеток моноцитарно-макрофагального звена [24][25]. Это обеспечивает широкий спектр применения Iba1, но не позволяет отличить клетки микроглии от макрофагов, если последние проникнут через ГЭБ при воспалительной инфильтрации. В то же время выбранные для эксперимента дозы ЛПС не привели к появлению признаков воспалительной инфильтрации или иных патологических изменений, видимых при световой микроскопии.

Эти данные согласуются с литературными источниками. Так, при режиме введения ЛПС мышам в дозе 2 мг/кг/сутки в/б в течение 3 суток, выбранном для моделирования нарушений аффекта и поведения, происходила активация как астроцитов, так и макрофагов [1]. Аналогичные морфологические изменения отмечены при в/б введении мышам ЛПС 0,25 мг/кг 7 раз в течение двух недель, что сопровождалось развитием повреждения нервной ткани, с помощью которого моделировали нейродегенеративные процессы [26]. Более высокие дозы ЛПС приводят к увеличению экспрессии Iba1 в клетках микроглии уже через несколько часов [27], поскольку ведут к нарушению целостности и проницаемости ГЭБ для большого количества популяций лейкоцитов [28–30].

Результаты проведенного исследования демонстрируют, что воздействие бактериального агента, приводящее к активации нейроглии, доступно количественной оценке по экспрессии ИГХ маркеров. В первые часы после введения ЛПС уровень Iba1 может не изменяться, а уровень GFAP реагирует и восстанавливается быстрее, чем уровень Iba1 [31].

Новизна настоящего исследования состоит в том, что режим введения ЛПС в течение 4 суток показан как эффективный с точки зрения одновременного изучения экспрессии GFAP и Iba1 в клетках нейроглии.

Следует подчеркнуть, что клетки, экспрессирующие GFAP, производят разное количество белков цитоскелета при различных повреждениях [18]. Другими словами, экспрессия GFAP является показателем активации астроцитов при воздействии типовым внешним сигналом повреждения, каковым является ЛПС. Именно такие сигналы в большей степени моделируют возрастные изменения при взаимодействии нейроглии и микробиоты толстой кишки, где E. coli составляет значительную долю бактерий [32].

В последнее время появляются сведения о положительной экспрессии маркера GFAP нейронами в ходе структурных изменений в нервной ткани при травматическом повреждении [33]. В сером веществе коры больших полушарий экспрессия GFAP наступает позже, чем в белом веществе, и в большей степени отражает усиление механической, опорной функции цитоскелета в астроцитах для укрепления ГЭБ [34].

Следует отметить, что введение ЛПС в некоторых случаях сопровождается морфологическими изменениями в нервной ткани головного мозга, например снижением количества клеток, которые могут быть определены при рутинных методах окрашивания (по Нисслю) [35]. Однако увеличение экспрессии ИГХ маркеров GFAP и Iba1 в нервной ткани является более специфичной оценкой.

Размер выборки в эксперименте был ограничен этической целесообразностью и концепцией 3R. Тем не менее полученные данные статистически значимы. Экстраполяция результатов эксперимента, выполненного на мышах, ограниченно возможна на человека.

Структурные изменения в нервной ткани при введении ЛПС могут развиваться в результате воздействия цитокинов, приводящего к изменению в жизненном цикле клеток нейроглии. Представляется перспективным изучение молекулярных каскадов и изменений в популяции нейронов при аналогичных дозе и способе введения ЛПС у мышей, а также реакции нейроглии и нейронов при воздействии других доз, режимах и способах введения ЛПС.

Введение в/б несептической дозы ЛПС в течение 4 суток приводит к астроцитарной и микроглиальной активации: увеличивается количество астроцитов с повышенным содержанием промежуточных филаментов (GFAP-положительных клеток), а также экспрессия маркеров макрофагов (Iba1) в цингулярной и ретросплениальной коре больших полушарий головного мозга. Изученная доза позволяет оценить изменения в ЦНС со стороны глии при повреждении, не сопровождающемся развитием воспалительной реакции.

А.А. Венедиктов, Г.А. Пьявченко и С.Л. Кузнецов сформулировали идею и разработали дизайн исследования. А.А. Венедиктов, Д.М. Оганесян и В.В. Голоборщева изучили литературные источники, провели эксперименты с животными и изготовили гистологические препараты. А.А. Венедиктов выполнил статистическую обработку результатов. А.А. Венедиктов, В.В. Голоборщева, Г.А. Пьявченко и С.Л. Кузнецов написали текст статьи. А.А. Венедиктов и К.С. Покидова оформили иллюстрации. Все авторы утвердили окончательную версию статьи.

Соответствие принципам этики. Исследование проведено с соблюдением положений Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей. Все манипуляции с животными проведены в соответствии с разрешением Локального этического комитета ФГБОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (№ 01-22 от 20.01.2022).

Доступ к данным исследования. Данные, подтверждающие выводы этого исследования, можно получить у авторов по обоснованному запросу.

Данные и статистические методы, представленные в статье, прошли статистическое рецензирование редактором журнала – сертифицированным специалистом по биостатистике.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки (собственные ресурсы).

1. Артикул ET1601-23, партия HO0913, Huabio, США. https://huabioresearch.com/datasheet/ET1601-23 (дата обращения: 11.07.2024). 2. Артикул ER1802-20, партия HL0213, Huabio, США. https://huabioresearch.com/datasheet/ER1802-20 (дата обращения: 11.07.2024). 3. Артикул HA1119, партия M05-22-P2, Huabio, США. https://huabioresearch.com/datasheet/HA1119 (дата обращения: 11.07.2024). 4. QuPath Open Software for Bioimage Analysis. https://qupath.github.io (дата обращения 07.10.2024).