Исследование выполнено на 36 мышах дикого типа (wild-type, WT) и трансгенных линий массой тела 32,0 ± 2,5 г, распределенных на шесть групп (n = 6 в каждой группе). До исследования допускались особи без сопутствующих патологий. Мыши получены из вивария Сеченовского университета.

В 1-ю группу включали мышей линии C57Bl/6 (WT, контрольная группа), отбор производился методом случайных чисел. Распределение на группы со 2-й по 6-ю производили на основании генотипа животных. Ко 2-й группе отнесены трансгенные животные с человеческим геном FUS[ 1-359], экспрессирующие мутантный белок FUS с развитием FUS-варианта БАС. Использовали модель FUS-экспрессии, описанную в работе T.A. Shelkovnikova и соавт. [11]. В 3-ю группу (HSP70out) включали трансгенных мышей с внеклеточной экспрессией HSPA1A, в 4-ю группу (HSP70in) – с внутриклеточной экспрессией HSPA1A. В группы со 2-й по 4-ю с учетом данных полимеразной цепной реакции отбирали животных с гемизиготным характером наследования FUS[ 1-359] и HSPA1A. Гомозиготных животных групп со 2-й по 4-ю использовали для выведения двойных трансгенных мышей: группа 5 (FUS[ 1-359]/HSP70out) и группа 6 (FUS[ 1-359]/HSP70in).

Мышей содержали в виварии при температуре 20–22 °C и влажности воздуха 55–60% с доступом к чистой воде и гранулированному корму ad libitum. У групп с экспрессией FUS начиная с 10–12 недель жизни постепенно нарастали проявления мышечной слабости вплоть до паралича у отдельных животных. Данные симптомы в первую очередь поражали одну из задних конечностей и могли распространяться на обе, иногда проявляясь также в передних конечностях. При этом снижалась половая активность, но не снижалась пищевая. В FUS-отрицательных группах этих изменений не было.

На 20-й неделе животных выводили из эксперимента путем декапитации (рис. 1), для анестезии использовали 5 мг/кг ксилазина гидрохлорида (Interchemie, Нидерланды) и 40 мг/кг тилетамина/золазепама (Virbac, Франция).

Производили забор головного мозга с фиксацией в 10% нейтральном забуференном формалине (ООО «ЭргоПродакшн», Российская Федерация). Через сутки выполняли проводку через изопропиловый спирт возрастающей концентрации (ООО «Биовитрум», Российская Федерация) и заливку в парафин. На ротационном микротоме HM325 (Thermo Fisher Scientific, США) изготавливали корональные срезы толщиной 3 мкм, переносили их на предметные стекла с силановым адгезивным покрытием (ООО «Минимед», Российская Федерация) и подсушивали в термостате при температуре 37 °C.

Для гистологического исследования препараты окрашивали гематоксилином и эозином или толуидиновым синим по методу Ниссля. Для иммунофлуоресцентного (ИФ) окрашивания после выдержки в демаскировочном растворе (рН 9,0, 20×, партия XF05RT4N9592, Elabscience, КНР) срезы промывали 10% PBS (ООО «Эко-Сервис», Российская Федерация), добавляли бычий сывороточный альбумин (партия RM-T1725/1000, Biosera, Франция) на 30 минут и использовали первичные антитела в соответствии с рекомендациями производителя.

Для выявления нейронов использовали моноклональные антитела к нейрональному ядерному маркеру (neuronal nuclear marker, NeuN, 1:1000, клон SR45-07, артикул ET1602-12, партия H661803001, Huabio, КНР). Для обнаружения активированных астроцитов применяли моноклональные антитела к глиальному фибриллярному кислому белку (glial fibrillary acidic protein, GFAP, 1:500, клон SA03-04, артикул ET1601-23, партия HO0913, Huabio, КНР), и к белку S100β (1:1000, клон SC57-02, артикул ET-1610-3, партия H661380007, Huabio, КНР). Для выявления уровня синаптических контактов использовали поликлональные антитела к белку синаптофизину (synaptophysin; SYP, 1:200, артикул O407-2, партия HG0614, Huabio, КНР). После окрашивания первичными антителами образцы трижды промывали и наносили поликлональные вторичные антитела (Anti-Rabbit-TRITC, 1:100, артикул E-AB-1053, партия 22038, Elabscience, КНР) и окрашивали DAPI (артикул E-IR-R103, Elabscience, КНР). Образцы промывали PBS и заключали в монтирующую среду.

На полученных срезах определяли структуры лимбической системы грызунов (по 6 полей зрения от каждого животного). Согласно стереотаксическому атласу [12] выделяли: каудопутамен (caudoputamen, CP); каудальную часть латерального септального ядра (lateral septal nucleus, caudal or caudodorsal part; LSc); образования в гиппокампе, включая дорсальную часть основания гиппокампа, или субикулума (subiculum, dorsal part; SUBd), области собственно гиппокампа, или Аммонова рога (cornu Ammonis; CA1 и CA3), и зубчатую извилину (dentate gyrus; DG); ядра миндалевидного тела, а именно латеральное ядро (lateral amygdalar nucleus; LA), вентральную часть базолатерального ядра (basolateral amygdalar nucleus, ventral part; BLAv), переднюю и заднюю части базолатерального ядра (basolateral amygdalar nucleus, anterior and posterior parts; BLAa/BLAp) и латеральную часть центрального ядра (central amygdalar nucleus, lateral part; CeL). Фотографирование выполняли с помощью программно-аппаратного комплекса Axio Imager.A1 с увеличением объектива ×40 и ×100, включающего цветную камеру Axiocam 305 и программное обеспечение Zen 3.10 (Zeiss, Германия).

Подсчитывали количество нейронов в поле зрения для структур CP, LSc и миндалевидного тела. Для образований гиппокампа и LSc подсчитывали количество гиперхромных нейронов, а в CP учитывали количество нейронов с эозинофильной цитоплазмой. Для окрашивания антителами выполняли микрофотографии структур гиппокампа, CP и LSc при длине волны от 540 до 620 нм. Подсчитывали общее количество NeuN-положительных клеток в поле зрения в зонах CP и LSc и соотношение NeuN+-клеток к клеткам, окрашенным DAPI, в структурах гиппокампа.

Нейродегенеративными изменениями считали сокращение общего количества нейронов в поле зрения, появление гиперхромных нейронов или нейронов с эозинофильной цитоплазмой, а также сокращение количества NeuN-положительных клеток или значения соотношения NeuN/DAPI относительно группы контроля. В гиппокампе и зоне LSc также оценивали долю клеток с положительной реакцией к GFAP в поле зрения, выраженную в процентах, и количество S100β-положительных клеток в поле зрения. Увеличение экспрессии GFAP и S100β расценивали как активацию астроцитов, а вместе с нейродегенеративными изменениями – как показатель нейровоспаления. Для гиппокампа и зоны CP рассчитывали уровень экспрессии SYP, выраженный как соотношение между площадью экспрессии SYP к площади поля зрения в процентах. Площадь экспрессии SYP в поле зрения оценивалась при помощи программного обеспечения с машинным обучением и открытым кодом QuPath 0.5.0 [13].

Данные ИФ исследования оценивали на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро – Уилка. Средние значения выборок сравнивали при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием апостериорного критерия Тьюки. Различия при значении p менее 0,05 учитывали как статистически значимые, при этом размер выборки достаточен с учетом мощности 80% и соответствует принципам 3R. Статистические подсчеты выполнены с помощью программного обеспечения OriginPro (OriginLab, США).

Микрофотографии и графики количества клеток для срезов головного мозга в зонах CP и LSc показаны на рисунке 2. В зоне CP общее количество нейронов снижалось во всех группах с экспрессией мутантного FUS по сравнению с группами WT, HSP70in и HSP70out (рис. 2E). При этом в группе FUS[ 1-359]/HSP70out количество нейронов было меньше, чем у животных групп FUS[ 1-359] и FUS[ 1-359]/HSP70in.

Нейроны с эозинофильной цитоплазмой пригистологическом исследовании обнаружены только в зоне CP (рис. 2F). Их количество статистически значимо возрастало во всех группах с экспрессией FUS, достигая максимальных значений в группе FUS[ 1-359]/HSP70out. В группах FUS[ 1-359] и FUS[ 1-359]/HSP70in количество нейронов с эозинофильной цитоплазмой снижалось, но оставалось выше, чем в группах без FUS.

В отличие от зоны CP в зоне LSc количество нейронов снижалось не во всех группах с экспрессией FUS по сравнению с группой WT (рис. 2G). Уменьшение количества нейронов было характерно только для группы FUS[ 1-359]/HSP70out. При этом количество гиперхромных нейронов в зоне LSc (рис. 2H) было больше во всех группах с экспрессией FUS по сравнению с группой WT. Наименьшее количество гиперхромных нейронов было в группе FUS[ 1-359]/HSP70in, по сравнению с группами FUS[ 1-359] и FUS[ 1-359]/HSP70out.

Микрофотографии и графики количества клеток для срезов головного мозга в области гиппокампа приведены на рисунке 3. В зонах SUBd (рис. 3G), CA1 (рис. 3H) и DG (рис. 3J) количество гиперхромных нейронов повышалось во всех группах с экспрессией FUS по сравнению с группами WT, HSP70in и HSP70out. При этом в группе FUS[ 1-359]/HSP70in количество гиперхромных нейронов было ниже, чем в группах FUS[ 1-359] и FUS[ 1-359]/HSP70out. На срезах в зоне CA3 статистически значимых различий в количестве гиперхромных нейронов между группами обнаружено не было (рис. 3I).

Микрофотографии и графики количества клеток в поле зрения для срезов головного мозга в области миндалевидного тела представлены на рисунке 4. В зонах BLAv (рис. 4H), BLAa/BLAp (рис. 4I) и CeL (рис. 4J) общее количество нейронов снижалось в группах FUS[ 1-359] и FUS[ 1-359]/HSP70out по сравнению с группами WT, HSP70in и HSP70out. При этом в группе FUS[ 1-359]/HSP70in снижение количества нейронов относительно группы WT было зафиксировано только в зоне CeL. В зоне LA (рис. 4G) характер изменений при графическом анализе был аналогичен изменениям в других зонах миндалевидного тела, однако статистически значимо было только небольшое снижение количества нейронов в группе FUS[ 1-359] по сравнению с группой WT.

Результаты ИФ исследования зон CP и LSc приведены на рисунке 5. В обеих зонах отмечено снижение количества NeuN+-клеток в группах FUS[ 1-359] и FUS[ 1-359]/HSP70out. Уровень NeuN+-клеток в группе FUS[ 1-359]/HSP70in был выше, чем в других группах с экспрессией FUS, при этом в зоне CP – сопоставим с группой WT, а в зоне LSc – значимо ниже, чем в группе WT (рис. 5C, 5D).

На рисунке 6 представлены результаты ИФ исследования для структур гиппокампа. В зонах DG и CA1 доля GFAP+ и количество S100β+-клеток статистически значимо повышались в группах FUS[ 1-359], FUS[ 1-359]/HSP70out и менее выраженно в группе FUS[ 1-359]/HSP70in по сравнению c группой WT (рис. 6H, I, K, L). Небольшие различия в экспрессии SYP показаны только между группами с экспрессией FUS (рис. 6M).

В зоне CA1 отмечено резкое снижение соотношения NeuN+/DAPI+ (рис. 6J) в группах FUS[ 1-359] и FUS[ 1-359]/HSP70out. Напротив, в группе FUS[ 1-359]/HSP70in это соотношение было не только выше, чем в других группах с экспрессией FUS, но статистически значимо не отличалось от группы WT.

На рисунке 7 показаны результаты ИФ исследования в зоне LA. Во всех группах с экспрессией FUS (FUS[ 1-359], FUS[ 1-359]/HSP70out и FUS[ 1-359]/HSP70in) количество NeuN+-клеток было меньше по сравнению с группой WT и группами с моноэкспрессией HSP70. В то же время среди групп с мутантным FUS экспрессия NeuN была выше в группе FUS[ 1-359]/HSP70in, ниже – в группе FUS[ 1-359]/HSP70out.

Ключевым компонентом настоящей работы был адекватный подбор линии трансгенных животных с экспрессией HSP70 и FUS. Линия с моделью БАС выбрана по следующим критериям: 1) эффективность в развитии патологических и клинических проявлений FUS-варианта БАС хорошо изучена с доказанной экспрессией FUS; 2) есть выраженные нейродегенеративные проявления; 3) мыши доживают до возраста, при котором их можно скрещивать с грызунами других линий для выведения двойных трансгенных животных [6][11]. Линии с экспрессией HSPA1A выбраны, поскольку именно этот вариант HSP70 способен взаимодействовать с белком FUS при его цитоплазматической локализации [14].

Исследование выявило нейродегенеративные изменения при экспрессии мутантного FUS: сокращение количества нейронов, увеличение числа гиперхромных нейронов, снижение экспрессии NeuN и NeuN+/DAPI+, а также то, что сочетанная экспрессия внутриклеточного HSPA1A и мутантного FUS у мышей связана с меньшими уровнями нейродегенерации. При изначальном описании данной модели БАС отмечено нейродегенеративное поражение структур ствола мозга без уточнения характера изменений, свойственных лимбической системе [11].

В настоящей работе продемонстрировано сокращение количества нейронов в зоне CP у всех животных с экспрессией FUS. По сведениям литературы, структуры СР подвержены нейродегенеративным изменениям у людей с FUS-ассоциированным БАС [15]. Также ранее было показано увеличение электрической активности в зоне CP у мышей с экспрессией FUS [16]. Отметим, что в проведенном исследовании у животных с внеклеточной экспрессией HSPA1A (группа FUS[ 1-359]/HSP70out) выживаемость нейронов в CP ниже, чем у монотрансгенных животных с экспрессией FUS (группа FUS[ 1-359]), а у животных с внутриклеточной экспрессией (группа FUS[ 1-359]/HSP70in) – выше. Такие же данные были получены для количества клеток с положительной реакцией к NeuN – маркеру зрелых нейронов. Поскольку введение HSPA1A не приводит к нейродегенеративным изменениям в центральной нервной системе [9], можно предполагать, что экспрессия HSPA1A внеклеточно усугубляет характер патологических изменений при FUS-варианте БАС. Вместе с тем совместная экспрессия HSPA1A и FUS в цитоплазме нейронов СР положительно влияет на их сохранность.

В зоне CP также обнаружены нейроны с эозинофильными включениями в цитоплазме, причем их количество увеличивалось в группах с экспрессией FUS, особенно FUS[ 1-359]/HSP70out. Подобные включения по типу «вишневого пятна» ранее обнаруживали в ядрах нейронов гиппокампа при FUS-варианте лобно-височной деменции [17]. A. Murakami и соавторы сообщали также об обнаружении FUS-положительных включений в стриатуме на аутопсийном материале [18]. Данная находка, возможно, представляет собой еще одно свидетельство FUS-ассоциированных нейродегенеративных изменений. Однако накопленного экспериментального материала для сравнения недостаточно, чтобы полагать эозинофильные включения специфическим маркером.

Для структур лимбической системы (септальные ядра, гиппокамп) с большой концентрацией нейронов на единицу площади и, следовательно, с большей вероятностью искажений при сравнении для исследования учитывали не общее количество нейронов, а количество гиперхромных клеток. Этот параметр распространен для оценки нейродегенеративных изменений [19]. При исследовании зоны LSc количество гиперхромных нейронов, а также клеток, экспрессирующих NeuN, увеличивалось во всех группах с экспрессией FUS. Эти данные соответствуют общей динамике изменений в зоне CP, а именно, более выраженный уровень нейродегенеративных изменений в группах FUS[ 1-359] и FUS[ 1-359]/HSP70out по сравнению с группой FUS[ 1-359]/HSP70in. К настоящему времени работ, демонстрирующих изменения количества нейронов или гиперхромных нейронов в септальных ядрах у животных с экспрессией FUS или у людей, опубликовано не было.

В областях гиппокампа SUBd, CA1 и DG сохранена описанная выше для зон CP и LSc динамика изменений между группами. Количество гиперхромных нейронов увеличивалось при экспрессии FUS, но у мышей с одновременной внутриклеточной гиперэкспрессией HSPA1A (группа FUS[ 1-359]/HSP70in) было ниже, чем у других мышей с экспрессией FUS. Эти изменения сочетались со снижением экспрессии NeuN в группах с мутантным FUS, наименее выраженным в группе FUS[ 1-359]/HSP70in. Следует подчеркнуть, что в гиппокампе также наблюдался рост количества GFAP+- и S100β+-клеток, и для этих показателей различия по группам полностью совпадали с различиями для увеличения количества гиперхромных нейронов. Поскольку GFAP и S100β являются маркерами активированных астроцитов, их увеличение, возможно, отражает участие астроглии в реакцию на накопление FUS.

Гиппокамп в силу реализации когнитивных функций представляет отдельный интерес при БАС. Его чувствительность к изменениям в активности FUS показана в исследовании Kino и соавторов [20]. При экспрессии мутантного FUS у мышей снижались когнитивные функции и образование шипиков в гиппокампе, хотя в нем не было цитоплазматической локализации FUS [21]. Также продемонстрировано снижение уровней шипиков в гиппокампе и когнитивных функций у трансгенных мышей с экспрессией FUS и развитием БАС [22]. Тем не менее в нашем исследовании не обнаружено различий по площади ткани гиппокампа с положительной реакцией к SYP. Возможно, синаптическая передача вовлечена в FUS-патологию при БАС в меньшей степени, чем уровни шипиков.

Повышение экспрессии FUS, нейродегенеративные изменения и последующее восстановление количества нейронов в исследовании, в котором изучали ишемическое воздействие на гиппокамп, в некоторых случаях сопровождались кратковременным увеличением экспрессии HSP70 [23]. Можно предположить, что HSP70 в гиппокампе позволяет уменьшить негативные эффекты накопления FUS (рис. 8).

В миндалевидном теле в зоне большинства ядер, кроме латерального, количество нейронов уменьшалось во всех FUS-экспрессирующих группах, но в группе FUS[ 1-359]/HSP70in было минимальным. Это соответствует динамике для других изученных структур. В литературе мало сведений о поражении миндалевидного тела при БАС, но сообщалось об отсутствии экспрессии FUS в миндалевидном теле при FUS-варианте БАС [24].

Кроме того, ранее нами рассмотрены изменения в первичной моторной коре и спинном мозге на тех же моделях [25]. Во всех случаях продемонстрировано уменьшение нейродегенеративных изменений при одновременной гиперэкспрессии цитозольной формы HSPA1A и мутантного белка FUS с цитоплазматической локализацией.

Экстраполяция экспериментов с животными на человека ограничена. Настоящее исследование рассматривает не все зоны центральной нервной системы. Например, разнообразие зон коры у человека заведомо больше, поскольку у мышей нет извилин; мыши не имеют речевых центров.

Целесообразно установить молекулярные механизмы, способствующие положительному влиянию гиперэкспрессии HSP70 на замедление нейродегенеративных проявлений при FUS-варианте БАС. Регистрация электрических изменений в структурах лимбической системы позволит в дальнейшем полнее описать полученные модели двойных трансгенных мышей.

В настоящей работе изучены количественные показатели нейродегенеративных изменений в структурах лимбической системы у мышей с гиперэкспрессией белков теплового шока семейства HSP70 в форме HSPA1A и экспрессией мутантного человеческого белка FUS с транслокацией [ 1-359], свойственной для БАС. По данным исследования, одновременное присутствие белка HSPA1A вместе с мутантным белком FUS[ 1-359] в цитоплазме клеток нервной ткани в структурах лимбической системы сопровождается меньшими нейродегенеративными изменениями, чем при изолированной экспрессии мутантного FUS. При этом в наибольшей степени патологические изменения снижаются при сочетанной экспрессии FUS и внутриклеточной гиперэкспрессии HSPA1A в цитозольной форме. Выполненная работа демонстрирует, что гиперэкспрессия HSPA1A является потенциальным способом замедлить развитие FUS-варианта БАС.

Г.А. Пьявченко и С.Л. Кузнецов сформулировали идею и разработали дизайн исследования. К.С. Покидова и Е.А. Кузьмин провели эксперименты с животными, изготовили гистологические препараты и выполнили статистическую обработку результатов. А.А. Венедиктов изучил литературные источники и написал текст статьи. К.С. Покидова и Е.А. Кузьмин оформили иллюстрации. Г.А. Пьявченко и С.Л. Кузнецов провели научную редактуру статьи. Все авторы статьи утвердили окончательную версию статьи.

Соответствие принципам этики. Исследование проведено с соблюдением положений Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей. Все манипуляции с животными проведены в соответствии с разрешением Локального этического комитета ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России № 04-23 от 02.03.2023.

Доступ к данным исследования. Данные, подтверждающие выводы этого исследования, могут быть получены у автора по переписке по обоснованному запросу.

Конфликт интересов. С.Л. Кузнецов – член редакционной коллегии, не принимал участия в редакционном рассмотрении и принятии решений по данной статье.

Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-25-004481.

1 Карточка проекта фундаментальных и поисковых научных исследований, поддержанного Российским научным фондом. Изучение нейроиммунологических эффектов экстра- и внутриклеточного HSP70 при нейродегенеративном повреждении мозга у мышей. https://rscf.ru/project/23-25-00448/ (дата обращения: 01.12.2024).