В эксперименте использовались самцы мышей дикого типа линии C57BL/6J и самцы мышей линии APPswe/PS1dE9 на том же генетическом фоне (n = 5 в каждой группе). До исследования допускались особи без сопутствующих патологий. Мыши получены из вивария ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет). Исследование проводилось без применения слепого метода.

После прохождения двухнедельного карантина и осмотра ветеринарным врачом животные дикого типа и трансгенные мыши разводились в виварии в соответствии со всеми этическими нормами и требованиями к условиям содержания. В возрасте 2 месяцев животных генотипировали методом полимеразной цепной реакции с последующим гель-электрофорезом. По результатам генотипирования животных распределяли на две группы: интактную группу (без патологии), включавшую животных дикого типа, и экспериментальную группу, включавшую трансгенных мышей с моделью БА. Отбор животных производился методом случайных чисел. После формирования экспериментальной группы исключений не происходило. До достижения годовалого возраста животные содержались в виварии при температуре 22 °С и влажности воздуха 55–60% с доступом к чистой воде и гранулированному корму ad libitum.

По достижении животными возраста 1 года для дополнительной валидации проводили классические для изучения БА поведенческие тесты: «Открытое поле», «Приподнятый крестообразный лабиринт», «Водный лабиринт Морриса». Тесты проводились последовательно, с достаточными перерывами и обязательным соблюдением этапа привыкания к каждому тесту. Для оценки горизонтальной активности животных в поведенческих тестах использовалось программное обеспечение PoKi v0.0.1, с помощью которого осуществлялись детекция мыши, построение тепловых карт и получение данных о нахождении в зонах теста [14].

После того как животные прошли все поведенческие тесты, их анестезировали ксилазином в дозе 5 мг/кг (Interchemie, Кастенрее, Нидерланды) и тилетамином/золазепамом в дозе 40 мг/кг (Золетил-100; Virbac, Каррос, Франция), после чего умерщвляли путем перфузии 0,002% раствором гепарина с последующим выполнением процедуры прижизненной фиксации жидкостью Карнуа.

В начале иссекалась кожа головы, оголялся череп и происходил забор головного мозга. Далее рассекалась брюшная полость, выделялись желудок и кишечник. Аутопсийный материал желудка, тонкой и толстой кишки разделялся на три соответствующих участка, продольно разрезался, промывался раствором фиксатора и закручивался по технологии «швейцарский рулет». После все образцы проходили дополнительную фиксацию в жидкости Карнуа в течение 24 часов, затем их интенсивно промывали, проводили по изопропиловым спиртам и заливали в парафин.

Резка препаратов желудка и кишечника производилась на ротационном микротоме HM325 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США) поперечно виткам органа, а препараты головного мозга – на корональные срезы. Все препараты были нарезаны толщиной 3 мкм. Для лучшей фиксации препаратов использовали адгезивные стекла с силановым покрытием и подсушивали при температуре 56 °С.

Для идентификации амилоидных внеклеточных отложений в головном мозге использовалось общеморфологическое окрашивание сульфатированным альциановым синим (SAB, sulfated alcian blue) с докрашиванием нейтральным красным по Нисслю.

Часть препаратов использовали для иммуногистохимического исследования. Демаскировка происходила в демаскировочном буфере (One-step Dewaxing/Antigen Retrieval Buffer pH 9, каталог: E-IR-R220A, лот: XF05RT4N9592, Elabscience, Ухань, КНР) в течение 20 минут при температуре 98 °C и давлении 105 кПа. После остывания срезы промывали трижды в 10% фосфатно-солевом буфере (PBS, phosphate-buffered saline) (ООО «Эко-Сервис», Санкт-Петербург, Российская Федерация) и инкубировали с перекисью водорода в течение 30 минут в термостате 37 °C. После инкубации срезы трижды промывали PBS и инкубировали с 1% бычьим сывороточным альбумином (партия RM-T1725/1000, Biosera, Нуайе, Франция) в течение 30 минут в термостате 37 °C. Затем наносили первичные антитела и срезы инкубировали в течение 18 часов при комнатной температуре.

Для определения бета-амилоидных отложений использовали поликлональные кроличьи антитела против Aβ (1:200, каталог E-AB-15509, лот DM04J4P29901, Elabscience, Ухань, КНР). Для визуализации периферической нервной системы использовали поликлональные куриные антитела против периферина (1:1000, каталог GTX85464, лот 822503406, GeneTex, Ирвин, США). Для оценки синаптической иннервации использовали поликлональные кроличьи антитела против синаптофизина (SYP, synaptophysin; 1:200, каталог O407-2, лот HG0614, Huabio, Ханчжоу, КНР). Для оценки энтеральной глии и астроцитов в головном мозге использовали моноклональные кроличьи антитела против GFAP (1:500, клон SA03-04, каталог ET1601-23, лот HO0913, Huabio, Ханчжоу, КНР) и моноклональные кроличьи антитела против S100B (1:1000, клон SC57-02, каталог ET-1610-3, лот H661380007, Huabio, Ханчжоу, КНР).

После инкубации срезы желудка и кишечника трижды промывали PBS и наносили вторичные козьи антитела против кроличьих IgG, конъюгированные с флуорофором TRITC (tetramethylrhodamine isothiocyanate, тетраметилродаминизотиоцианат) (Goat Anti-Rabbit-TRITC, 1:100, каталог E-AB-1053, лот 22038, Elabscience, Ухань, КНР) и против куриного IgY, конъюгированные с FITC (fluorescein isothiocyanate, флуоресцеинизотиоцианат) (Goat Anti-Chicken-IgY-FITC, 1:1000, каталог GTX26873, лот 822503077, GeneTex, Ирвин, США), в них срезы инкубировали в течение 2 часов в термостате 37 °C. Затем срезы трижды промывали PBS и окрашивали ядерным красителем DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole, 4’,6-диамидино-2-фенилиндол) (каталог E-IR-R103, Elabscience, Ухань, КНР) в течение 15 минут в термостате 37 °C. После срезы промывали, проводили по спиртам с повышением концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в ксилолсодержащую среду Витрогель.

Препараты головного мозга после инкубации с первичными антителами также промывали в PBS и наносили вторичные козьи антитела с пероксидазой хрена (Goat Anti-Rabbit-HRP, ready to use, каталог HA1119, лот M05-22-P2, Huabio, Ханчжоу, КНР). Затем производили промывку в PBS, в качестве хромогена использовали 3,3’-диаминобензидин (CDH, Нью-Дели, Индия), инкубацию проводили в течение 1–2 минут, затем промывали дистиллированной водой и докрашивали препараты гематоксилином Карацци с последующим заключением в монтирующую среду.

Визуализация и гистологический анализ проводились с помощью микроскопа AxioImager.A1, камеры Axiocam 305 color и программного обеспечения Zeiss Zen 3.10 (Zeiss, Йена, Германия). Фотографирование препаратов, окрашенных иммунофлуоресцентным методом, проводили при длинах волн от 359 до 461 нм для DAPI, от 495 до 519 нм для FITC и от 557 до 576 нм для TRITC.

Измеряли площадь SYP+ сплетений с помощью классического инструмента работы с площадью Fiji 2.17.0. Для оценки структуры GFAP+ энтеральной глии использовали программное обеспечение с открытым исходным кодом CellSkeletDetector v0.0.2 [15]. Подсчитывали количество GFAP+ глии и бета-амилоидные скопления в головном мозге, Аβ+ нейроны в сплетениях, S100B+ клеток в и вне межмышечного сплетения.

Для определения минимально допустимого размера выборки был проведен пилотный эксперимент, на основе которого было рассчитано наименьшее значение для оценки статистической значимости возможных различий между группами. Нормальность распределения проверяли тестом Шапиро – Уилка. При подтверждении нормальности распределения (p > 0,05) для оценки достоверности различий между двумя независимыми группами использовали t-критерий Стьюдента. При сравнении показателей по Aβ, GFAР и S100B между отделами ЖКТ применяли однофакторный дисперсионный анализ (analysis of variance, ANOVA) с апостериорным тестом Тьюки. Различия между групповыми выборками считались значительными для p < 0,05 и статистической мощности более 0,8. Статистические подсчеты выполнены с помощью GraphPad Prism 10.4.0 (GraphPad Software, Сан-Диего, США).

Тепловые карты траекторий движения животных в поведенческих тестах представлены на рис. 1А. В тесте «Открытое поле» мыши APPswe/PS1dE9 по сравнению с животными дикого типа демонстрировали увеличение общей пройденной дистанции (рис. 1В) и средней скорости движения (рис. 1С), а также снижение числа остановок (рис. 1D). Одновременно у APPswe/PS1dE9 отмечалось увеличение числа заходов в центральную зону теста (рис. 1Е). Данные изменения указывают на выраженное повышение двигательной активности у мышей APPswe/PS1dE9.

В тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» мыши APPswe/PS1dE9 показали аналогичные результаты повышения общей дистанции (рис. 1F). Для трансгенных животных было характерно увеличение числа входов в закрытые рукава, что дополнительно указывает на усиление локомоторной активности (рис. 1Н). При этом не было показано различий в переходах в открытые рукава для животных дикого типа и APPswe/PS1dE9 (рис. 1G), что говорит об отсутствии явных признаков повышения тревожности. Повышенное время пребывания в центральной зоне может отражать более частые переходы между участками лабиринта, усиленное исследовательское поведение (рис. 1I).

После прохождения 5-дневного обучения с платформой в тесте «Водный лабиринт Морриса» оценивалось плавание мышей без платформы. Мыши APPswe/PS1dE9 проводили меньше времени в целевом квадранте с мнимой платформой по сравнению с животными дикого типа (рис. 1J). Кроме того, у APPswe/PS1dE9 было снижено количество пересечений зоны с мнимой платформой (рис. 1К) и увеличено латентное время достижения зоны платформы (рис. 1L). При этом скорость плавания между животными дикого типа и APPswe/PS1dE9 была статистически не различима (рис. 1М). Эти изменения свидетельствуют о нарушении сохранности пространственной памяти и снижении точности поиска прежнего местоположения платформы у животных APPswe/PS1dE9.

Гистохимическое исследование с использованием модифицированного метода SAB выявило депозиты, характеризующиеся неравномерным распределением по всему мозгу (рис. 2А). С помощью SAB были выявлены многочисленные отложения у мышей APPswe/PS1dE9 в зонах СА1, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа и коре больших полушарий головного мозга.

Иммуногистохимическое исследование с использованием антител против Aβ подтвердило, что окрашенные SAB структуры являются амилоидными бляшками (рис. 2F). Окрашивание против Аβ также выявило внутриклеточную локализацию отложений, в особенности у клеток микроокружения бляшек (рис. 2F). При исследовании изокортекса наибольшее число отложений было выявлено в зоне СА1 гиппокампа и первичной аудиальной коре (рис. 2В и 2С). У животных дикого типа реакции против Аβ выявлено не было.

Иммуногистохимическое исследование против GFAP выявило выраженное повышение его активации в коре больших полушарий и гиппокампе мышей APPswe/PS1dE9 (рис. 2G). В свою очередь, у животных дикого типа обнаруживались единичные GFAP+ клетки на поле зрения в аналогичных зонах мозга (рис. 2D и 2Е).

С помощью иммуногистохимического анализа против Aβ было показано наличие цитоплазматического окрашивания в нейронах межмышечного сплетения APPswe/PS1dE9 (рис. 3А). У животных дикого типа не наблюдается окрашивания против Аβ. При сравнении числа положительно окрашенных нейронов в межмышечном сплетении между желудком и тонкой кишкой разница не была выявлена (рис. 3В). Окрашивание против Аβ в толстой кишке показало, что количество позитивных нейронов в поле зрения было значимо больше, чем в желудке и тонкой кишке.

Для оценки везикулярного транспорта в нейронах межмышечного сплетения использовалась иммуногистохимическая реакция с антителами против SYP. У животных APPswe/PS1dE9 в энтеральных нейронах тонкой и толстой кишки было выявлено повышение площади окрашивания против SYP (рис. 4А и 4В). В свою очередь, в межмышечном сплетении желудка окрашивание SYP в среднем занимало меньшую площадь у APPswe/PS1dE9, чем у животных дикого типа.

Иммуногистохимическое исследование с использованием маркеров GFAP и S100B позволило оценить реакцию со стороны двух популяций энтеральной глии (рис. 5A–F). В межмышечном сплетении кишечника наблюдалось увеличение реактивности GFAP+ глии (рис. 5А). Это проявлялось увеличением числа и степени разветвленности отростков по данным скелетизации (рис. 5B и C). В межмышечном сплетении желудка наблюдаются обратные эффекты. Степень ветвления GFAP+ глии выраженно снижается, притом что количество узлов остается на уровне животных дикого типа.

S100B в желудке и кишечнике экспрессируется популяцией глии, подобной шванновским клеткам. У мышей S100B+ клетки локализуются как в межмышечном и подслизистом сплетениях, так и вдоль нервных волокон в подслизистом слое (рис. 6А). Иммуногистохимическое исследование с антителами против S100B в межмышечном сплетении желудка и тонкой кишки не выявило значимых отличий (рис. 6В). В свою очередь, наблюдалось снижение числа S100B+ клеток в межмышечном сплетении толстой кишки APPswe/PS1dE9. При исследовании активности S100B вне сплетений в подслизистой и мышечной оболочках обнаружилось увеличение реакции во всех отделах ЖКТ у животных APPswe/PS1dE9 (рис. 6С).

В нашем исследовании у животных APPswe/PS1dE9 была повышена двигательная активность при прохождении тестов «Открытое поле» и «Приподнятый крестообразный лабиринт», которая характеризовалась увеличением общей дистанции и средней скорости. Также животные осуществили меньше остановок и больше заходили в центральную часть обоих тестов. Полученные результаты согласуются с ранее описанными в литературе данными о нарушении поведенческой активности у трансгенных животных с моделью БА. В работе R. Lalonde et al. [16] у 12-месячных мышей APP(695)swe/co+PS1dE9 было показано, что трансгенные животные демонстрируют изменения исследовательской активности в тестах «Открытое поле» и «Приподнятый крестообразный лабиринт», которые характеризовались увеличением времени нахождения в открытых рукавах в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт», увеличением дистанции в центральной зоне в тесте «Открытое поле».

При прохождении теста «Водный лабиринт Морриса» животные APPswe/PS1dE9 проводили меньше времени в квадранте с мнимой платформой, реже пересекали зону мнимой платформы и дольше достигали этой зоны по сравнению с животными дикого типа, что свидетельствует о снижении пространственной памяти у трансгенных животных. Похожие результаты были получены в работе L. Fu et al. [17] у животных APPswe/PS1dE9. Было показано прогрессирующее снижение пространственной памяти у трансгенных животных, которое характеризовалось снижением числа пересечений зоны платформы, уменьшением времени и дистанции в целевом квадранте по сравнению с животными дикого типа.

У животных APPswe/PS1dE9 было выявлено избыточное накопление бета-амилоидных бляшек в головном мозге. Это было показано в зоне СА1 гиппокампа и первичной слуховой коре. По данным литературы, эти зоны мозга являются основными, в которых выявляются бета-амилоидные агрегаты [18][19]. Отложение бляшек сопровождалось выраженным астроглиозом. Подобные изменения являются классическими для данной трансгенной линии и подтверждают воспроизведение основных признаков модели [20].

Наше исследование демонстрирует, что у мышей линии APPswe/PS1dE9 в возрасте 1 год в желудке, тонкой и толстой кишках развиваются выраженные морфологические изменения. Патологический процесс активно протекает в нейронах и энтеральной глии межмышечного сплетения. Выявлена зависимость степени нарушений во всех слоях в краниокаудальном направлении. Это подтверждается современными исследованиями, которые описывают дистальную часть толстой кишки, как основное место поражения у мышей APPswe/PS1dE9 [12]. В литературе описано отсутствие кишечных проявлений у мышей линии 5xFAD, которая, в свою очередь, характеризуется более агрессивным амилоидозом в ЦНС в связи с наличием большего числа мутаций APP и PS1. Можно предположить, что наличие изменений в ЖКТ связано с особенностью генетической кассеты APPswe/PS1dE9, которая находится под контролем прионного промотора. Вероятно, и другие линии, экспрессирующие мутантные гены, связанные с БА, под контролем прионного промотора, будут также характеризоваться кишечными проявлениями. Это подтверждается наличием изменений энтеральной нервной системы у животных линии TgCRND8, которая также имеет прионный промотор [21].

С точки зрения амилоидной патологии ключевыми наблюдениями стали выраженные цитоплазматические изменения в энтеральных нейронах. Они проявляются не только внутриклеточным накоплением Aβ, но и, по-видимому, нарушением их секреторной функции, на что косвенно указывает повышение уровня SYP. Накопления Aβ в большей степени были выражены в цитоплазме нейронов межмышечного сплетения толстой кишки. Наши данные согласуются с представленными в литературе исследованиями иммунореактивности Aβ с помощью иммуноферментного анализа, где у мышей APPswe/PS1dE9 и у гуманизированной линии AppNL-G-F было показано возрастание Aβ1-40 и Aβ1-42 форм амилоида в толстой кишке в 3, 6 и 12 месяцев [22]. Также имеются данные о наличии повышенной иммунореактивности, определенной по иммуноферментному анализу, в отделах тонкой кишки трансгенных животных с гиперэкспрессией мутантных форм Aβ [23]. В литературе описано, что у мышей APPswe/PS1dE9 накопление Aβ в энтеральной нервной системе приводит к гибели энтеральных nNOS+ нейронов [24].

В нашем исследовании было определено, что нарушения работы нейронов могут быть связаны с нарушением везикулярного транспорта за счет изменения активности SYP. Явное повышение иммунореактивности SYP в нейронах межмышечного сплетения было показано в кишечнике мышей APPswe/PS1dE9. Такое состояние может быть связано с нейрональным стрессом и возникает при ряде патологий ЖКТ воспалительной этиологии.

Примечательно, что энтеральная глия реагирует на отложение амилоида по механизму, сходному с реакцией астроцитов в ЦНС при БА. Выявленные нами морфологические признаки активации глиальных клеток свидетельствуют о запуске нейровоспалительного каскада в кишечной стенке, аналогичного центральному глиозу. GFAP считается маркером астроцитоподобного типа энтеральной глии, которая по функции и генной сигнатуре соответствует астроцитам ЦНС [25]. По результатам иммуногистохимического исследования выявлено повышение GFAP-иммунореактивности в кишечнике, наиболее выраженное в толстой кишке. Данное наблюдение дополнительно доказывает, что характер развития патологии распространяется в краниокаудальном направлении.

Увеличение иммунореактивности S100В, маркирующего популяцию немиелинизирующих шванновских клеток (нейролеммоцитарную энтеральную глию), свидетельствует об усилении их трофической и модуляторной активности вне межмышечного сплетения мышей APPswe/PS1dE9 [26]. Можно полагать, что в условиях накопления Aβ вне межмышечного сплетения избыточное высвобождение S100В изменяет кальциевый гомеостаз и возбудимость энтеральных нейронов, внося вклад в развитие моторных нарушений толстой кишки.

Основным ограничением исследования является то, что изменения в энтеральных сплетениях человека при БА могут быть выражены значительно сильнее, чем изменения, воспроизводимые на животных моделях. У лабораторных грызунов соответствующий фенотип, как правило, формируется при наличии мутаций генов APP, PS1; при этом такие модели не воспроизводят нейрофибриллярную патологию, играющую важную роль в развитии БА у человека. В свою очередь, основной вариант БА у человека (около 95% случаев) является спорадическим, что затрудняет его воспроизведение у грызунов. Кроме того, профиль экспрессии большинства промоторов у мышиных линий зачастую не соответствует профилю экспрессии генов APP и PS1 у человека. Дополнительным ограничением является проведение исследования без применения слепого метода.

Наиболее перспективной задачей является исследование фармакологических и биологических факторов, которые могут влиять на прогрессирование кишечных проявлений БА. Особый интерес представляет изучение факторов, способных замедлить развитие патологических изменений в ЦНС за счет снижения эффектов Aβ в ткани кишечника. Особого внимания заслуживают исследования на недавно полученных мышиных линиях с мутациями генов APOE4 и TREM2, которые связаны со спорадическими формами БА.

В настоящей работе изучены качественные и количественные морфологические изменения в желудке, тонкой и толстой кишках у мышей APPswe/PS1dE9 с моделью болезни Альцгеймера. Выявлено, что изменения усиливаются от проксимальных к дистальным отделам ЖКТ и характеризуются изменениями в нейронах и энтеральной глии.

А.Н. Яцковский: разработка концепции и дизайна исследования, научное редактирование рукописи. К.С. Покидова: проведение эксперимента, изготовление гистологических препаратов, статистическая обработка данных, анализ литературных источников, подготовка текста рукописи, оформление иллюстраций. Е.А. Кузьмин: проведение гистологических и иммуногистохимических исследований, анализ литературных источников, подготовка текста рукописи, оформление иллюстраций. Все авторы утвердили окончательную версию статьи.

Соответствие принципам этики. Исследование проведено с соблюдением положений Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей. Все манипуляции с животными проведены в соответствии с разрешением Локального этического комитета ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России № 04-23 от 02.03.2023.

Доступ к данным исследования. Данные, подтверждающие выводы этого исследования, могут быть получены у автора, ответственного за переписку, по обоснованному запросу.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки (собственные ресурсы).

Использование искусственного интеллекта. Инструменты искусственного интеллекта не использовались при подготовке данной рукописи.