Интраабдоминальная гипертензия (ИАГ) – устойчивое или повторяющееся повышение интраабдоминального давления (ИАД) выше 12 мм рт. ст. [1]. У 30% детей ИАГ сопровождается развитием органной дисфункции [2], а показатели смертности сохраняются на высоком уровне и достигают 60%, а в группе новорожденных – 70–90% [3].

Одними из первых клинических проявлений ИАГ являются гипоксия и гиперкапния. Результатами исследований установлено, что длительная гипоксия у крыс вызывает повреждение височно-нижнечелюстного сустава (ВНЧС), тканей слюнных желез, снижение секреторной функции и изменение состава слюны. Гистологический анализ слюнных желез крыс показал структурные изменения секреторных клеток [4].

Известно, что любое повреждение органа сопровождается повышением в биологических жидкостях молекулярных маркеров воспаления и гипоксии [5].

Цель исследования – установить влияние экспериментальной ИАГ на зубочелюстную систему (ЗЧС) крыс в отдаленном периоде на основе изучения провоспалительных цитокинов и морфологического анализа элементов ВНЧС и слюнных желез.

Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (протокол № 16-19) от 04.12.2019. Исследования на экспериментальных животных проводились в соответствии с ГОСТ 33215-2014 от 01.07.20161, ГОСТ 33216-2014 от 01.07.20162 и Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition)3.

Для моделирования ИАГ использовались самки крыс линии Wistar с выводками (по 7–10 крыс у каждой особи). Выбор животных был обусловлен сходством строения ВНЧС и продуктов секреции слюнных желез с таковыми у человека. Каждая самка с пометом содержалась в отдельной поликарбонатной клетке (после предварительной дезинфекции и обработки) при температуре 19–23 °C и круглосуточном световом режиме (12 часов света, 12 часов темноты), со свободным доступом к воде и еде. Помет находился на естественном вскармливании.

Расчет необходимого размера выборки выполнен с помощью открытого программного обеспечения G*Power 3.14 с учетом следующих параметров: однофакторный дисперсионный анализ, большая величина эффекта (Cohen’s f = 0,40), уровень значимости 0,05, мощность 0,80, 3 группы исследования. Расчет показал, что необходимый объем выборки составляет 60 особей.

Моделирование ИАГ: под контролем внутрипузырной манометрии в брюшную полость вводили стерильный объемообразующий коллагеновый филлер в количестве, необходимом для создания заданного уровня ИАД. Подробное описание модели ИАГ у новорожденных крыс было приведено нами в предыдущем исследовании [5].

Новорожденные крысы Wistar (n = 60) были разделены на три группы (рис. 1):

Первая точка исследования: через 10 дней после создания ИАГ 30 животным (по 10 крыс из каждой группы) была проведена общая анестезия препаратами гидрохлорида кетамина (90 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). После устранения роговичного рефлекса и рефлекса отдергивания лапы был выполнен забор крови из полости левого желудочка. Полученные образцы сыворотки крови хранили при t –80 ºС в пробирках с крышками «Эппендорф». По завершении манипуляций животных выводили из эксперимента путем декапитации с соблюдением правил эвтаназии согласно требованиям п. 12 Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном отношении к животным.

Вторая точка исследования: через 120 дней после ИАГ оставшимся 30 животным (по 10 крыс из каждой группы) проведена общая анестезия вышеуказанными препаратами. После введения в наркоз выполнен забор крови из полости левого желудочка, проведены операции по забору ВНЧС, околоушных слюнных желез. Правую железу и левый ВНЧС фиксировали в 10% формалине и заливали в парафин. Парафиновые срезы ВНЧС и слюнных желез окрашивали гематоксилином и эозином. По истечении операций животных выводили из эксперимента тем же способом, что и после первой точки исследования. Изучение биопсийного материала на светооптическом уровне и его фотосъемку осуществляли на микроскопе Leiсa DM2000 (Вецлар, Германия) со встроенной цифровой фотокамерой.

В первой и второй точках исследования в сыворотке крови определяли содержание следующих цитокинов: IL-18 (interleukin-18 – интерлейкин-18), NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin – липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1 – моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1) с помощью мультиплексного анализа с применением почечной панели (Bio-plex MAGPIX and PC, Bio-Rad). Для определения VEGF-C в первой точке (vascular endothelial growth factor С – васкулоэндотелиальный фактор роста тип С) использовали тест-системы BCM Diagnostics и Bender Medsystems (Австрия) для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) на анализаторе Stat Fax 2010 (Stat Fax, США).

Во второй точке исследования проводили морфологическое исследование ВНЧС и слюнных желез. В обеих структурах оценивались воспаление и дисциркуляторные нарушения, в ВНЧС – дегенерация костного мозга, в слюнных железах – гиперплазия лимфоидной ткани. Выбор сроков проведения морфологического исследования на 120-е сутки после моделирования ИАГ объяснялся формированием к этому времени полного комплекта зубов и созреванием всех элементов ЗЧС.

Статистический анализ данных

Проверку гипотезы на нормальность распределения проводили с помощью теста Шапиро – Уилка. Количественный данные представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (ИКР, 25-й, 75-й процентили). Различие между независимыми выборками оценивали с использованием критерия Краскела – Уоллиса (с целью коррекции множественных сравнений применялась поправка Данна), для сравнения непараметрических данных использовался точный критерий Фишера. Данные обрабатывались с помощью программы Statistica 13.0 (TIBCO, США).

Первая точка исследования

Содержание NGAL, IL-18 и МСР-1 в сыворотке крови во 2-й группе по сравнению с контролем было статистически значимо повышено (p < 0,02; p < 0,005; p < 0,006 соответственно). Аналогичные изменения данных цитокинов получены и в 3-й группе (p < 0,02; p < 0,005; p < 0,007 соответственно) (табл. 1).

Уровень VEGF в сыворотке крови относительно группы контроля был значимо повышен во 2-й группе (p < 0,02) (табл. 1).

Вторая точка исследования

Содержание NGAL, IL-18, и МСР-1 в сыворотке крови во 2-й группе по сравнению с контролем было статистически значимо повышено (p < 0,01; p < 0,04; p < 0,001 соответственно). Аналогичные изменения данных цитокинов получены и в 3-й группе (p < 0,01; p < 0,017; p < 0,008 соответственно) (табл. 1). При этом во 2-й точке концентрация МСР-1 увеличивалась пропорционально тяжести ИАГ с достижением максимальных значений в 3-й группе (p < 0,01) (табл. 1).

Анализ морфологического строения ВНЧС в группе 1 (контроль) показал, что синовиальные оболочки, покрывающие гиалиновый хрящ, содержали кровеносные и лимфатические капилляры, нервные окончания, элементы костной и костномозговой ткани, имели фиброзный тип строения и состояли из синовиоцитов, располагающихся на фиброзной ткани, представленной фибробластическими элементами и экстрацеллюлярным матриксом.

Во 2-й группе синовиальные оболочки, покрывающие гиалиновый хрящ, были умеренно или незначительно инфильтрированы лимфогистиоцитами и плазматическими клетками. Отмечалось очаговое слущивание синовиоцитов с их гиперплазией, но с сохранением фиброзного типа строения (рис. 2А). В двух случаях воспалительные изменения соответствовали синовииту умеренной степени активности, в семи – низкой степени активности. Изменений костной и костномозговой ткани в этой группе не отмечено.

В 3-й группе синовиальные оболочки были значительно инфильтрированы лимфогистиоцитами и плазматическими клетками (рис. 2B). Воспалительный инфильтрат у трех животных распространялся на хрящевую ткань с развитием участков лизиса. Регистрировалось очаговое слущивание синовиоцитов и их гиперплазия. Установлено распространение воспалительного инфильтрата на прилежащую жировую ткань, разрушение костной и костномозговой ткани. Таким образом, у преобладающего числа крыс (n = 9) наблюдался синовиит выраженной степени активности.

Анализ морфологического строения слюнных желез смешанного типа в группе 1 показал, что последние были представлены альвеолярными концевыми отделами с признаками белково-синтетической активности (белковый тип). Визуализировались выводные протоки, окруженные тонкой соединительнотканной прослойкой, в трех случаях – белковые полулуния (рис. 3А).

Во 2-й группе строение слюнных желез не отличалось от 1-й группы. В 3-й группе большинство крыс (n = 8) были с признаками сиаладенита: строма (преимущественно перидуктальная) массивно инфильтрирована лимфогистиоцитами и плазматическими клетками (рис. 3B). В регионарных лимфатических узлах выявлены признаки гиперплазии лимфоидной ткани. У двух крыс патологии не выявлено.

Сравнительный анализ морфологических изменений образцов ВНЧС и слюнных желез представлен в таблице 2. В группах 2 и 3 воспаление ВНЧС наблюдалось статистически значимо чаще, чем в группе контроля (p = 0,0002).

В группе 3 дисциркуляторные нарушения и дегенерация костного мозга при изучении ВНЧС, а также воспаление, дисциркуляторные нарушения и гиперплазия лимфоидной ткани слюнных желез наблюдались статистически значимо чаще по сравнению с 1-й и 2-й группами (p = 0,0002).

На фоне ИАГ повреждаются все органы и системы организма человека. Увеличение ИАД приводит к дисфункции всех органов брюшной полости и забрюшинного пространства за счет патологического изменения кровообращения: снижения притока артериальной крови, обструкции венозного оттока, микроциркуляторных нарушений [6].

В ходе исследования установлено, что содержание IL-18, МСР-1 и NGAL в сыворотке крови было статистически значимо повышено во 2-й и 3-й группах по сравнению с контролем через 10 и 120 дней после моделирования ИАГ. При этом максимальные значения биомаркеров наблюдались при более тяжелой степени ИАГ – в 3-й группе. Повышение этих цитокинов в сыворотке крови было обнаружено у новорожденных с ИАГ [7]. Основной функцией IL-18 и МСР-1 является обеспечение миграции моноцитов в очаги повреждения клеток с формированием моноцитарно-макрофагального инфильтрата, что становится фактором риска персистенции воспаления и перехода его в хроническое при повреждении органов и тканей в условиях ИАГ [7].

В литературе имеются данные, согласно которым в ходе проведения иммуногистохимического анализа и полимеразной цепной реакции в ткани поврежденной слюной железы идентифицирован высокий уровень экспрессии NGAL и матричной РНК NGAL соответственно. Была установлена прямая корреляция между степенью воспаления слюнных желез и концентрацией в ней данного цитокина [8]. Кроме того, выявлено, что повышение содержания указанного маркера в слюне и сыворотке крови может быть связано не только с поражением железистой ткани, но и с гингивитом и парадонтитом [9][10]. Возможно, полученные нами высокие значения указанного биомаркера в сыворотке крови были следствием патологических изменений в тканях ротовой полости, что согласуется с литературными данными [11].

Уровень VEGF-C был повышен во 2-й группе, что указывало на мобилизацию механизмов адаптации в виде ангиогенеза с момента начала действия гипоксического фактора. Влияние гипоксии на организм хорошо изучено, однако ее роль в поддержании здоровья полости рта до сих пор не ясна. Суставной хрящ – уникальная ткань, клетки которой потребляют значительно меньше кислорода, чем другие [12]. Суставной хрящ не имеет сосудов, поэтому все питательные вещества, включая кислород, доставляются к хондроцитам путем диффузии из синовиальной жидкости. В норме данная структура существует при низком давлении кислорода (~5%). Несмотря на то что хондроциты стойко переносят дефицит кислорода в течение длительного времени, при продолжительно низком его напряжении скорость синтеза матрикса и выработки энергии замедляется [11]. В ответ на гипоксию активируются различные пути регуляции, включая активацию HIF (hypoxia inducible factor, фактор, индуцируемый гипоксией), который регулирует метаболизм и жизненный цикл клетки [12]. Низкое напряжение кислорода и HIF-1α – факторы, определяющие состояние суставных хондроцитов как во время поддержания гомеостаза хряща, так и при развитии патологии. HIF-1α – фактор транскрипции, регулирующий метаболизм клеточной энергии, ангиогенез, апоптоз и пролиферацию клеток, синтез матрикса суставными хондроцитами и хондроцитами пластинки роста [13].

A.R. Terrizzi и соавт. [14] установили, что при периодической гипоксии у крыс, находящихся в условиях барокамеры, наблюдался повышенный катаболизм HIF-1α. Полученные данные указывали на низкий уровень транскрипции генов, необходимых для адаптации к стрессорному фактору. Это приводило к дискоординации в работе защитных механизмов, обеспечивающих нормальную функцию желез. Выраженный воспалительный ответ ассоциировался с высокими показателями простагландина E2 в тканях десны, что могло объяснить гипосаливацию у взрослых крыс в эксперименте. Морфологический анализ при помощи электронной микроскопии позволил определить апоптоз клеток в ацинусах и вставочных протоках, а также низкое количество секреторных гранул, которые были неравномерно распределены в ацинусах поднижнечелюстной слюнной железы [14].

Длительная гипоксия, ассоциированная с тяжелой ИАГ, приводила к выраженным структурным нарушениям элементов ЗЧС крыс по сравнению с группой легкой ИАГ и контроля. Наблюдались дисциркуляторные нарушения, гиперплазия лимфоидной ткани, дегенерация костного мозга.

Таким образом, установлено, что с увеличением ИАД морфологические изменения наблюдались одновременно во всех структурах ЗЧС и носили более выраженный характер у крыс с тяжелой степенью ИАГ. Оценивая характер изменения уровней IL-18, NGAL, МСР-1, VEGF-C в сыворотке крови, установили, что наибольшая концентрация данных цитокинов отмечалась в группе с максимальными значениями ИАД и сопровождалась грубыми морфологическими изменениями элементов ЗЧС. Полученные данные подчеркивают системный характер повреждения в ответ на гипоксию.

Небольшая выборка и моделирование ИАГ на новорожденных крысах, которые более устойчивы к действию гипоксии, ограничивают экстраполяцию результатов исследования на течение патологии человека. Однако обнаруженные изменения указывают на потенциальную возможность повреждения слюнных желез и ВНЧС у детей и диктуют необходимость проведения дальнейших исследований.

В отдаленном периоде при экспериментальной ИАГ установлено: 1) повышение уровней маркеров воспаления и гипоксии в сыворотке крови крыс; 2) выраженность синовиита и сиаладенита нарастала с увеличением уровня ИАД; 3) максимальные изменения маркеров воспаления и морфологические изменения ВНЧС и слюнных желез крыс отмечались в группе с тяжелой степенью ИАГ.

ВКЛАД АВТОРОВ

О.Л. Морозова и А.А. Мамедов разработали основную концепцию и дизайн исследования, а также проводили редактуру статьи. Н.С. Морозова и Л.Д. Мальцева проводили эксперимент, отбирали и анализировали биоматериал, проводили лабораторные исследования. Д.Ю. Лакомова занималась интерпретацией полученных лабораторных данных, а также написала основную часть финальной версии статьи. Все авторы утвердили окончательную версию публикации.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имеет спонсорской поддержки.

1. https://www.internet-law.ru/gosts/gost/61242/ 2. https://www.internet-law.ru/gosts/gost/62388/ 3. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Восьмое издание / пер. с англ. под ред. И.В. Белозерцевой, Д.В. Блинова, М.С. Красильщиковой. М.: ИРБИС, 2017. 336 с. 4. https://gpower.software.informer.com/3.1/