Животные

Проведено экспериментальное исследование на 36 крысах линии Wistar: 18 самцов и 18 самок, разделенных по возрасту 2, 7 и 16 месяцев на 6 групп по 6 крыс в каждой [3]. Нами были отобраны животные соответствующего возраста, представляющие три возрастные категории: молодые, взрослые и старые крысы. Животные получены из филиала ФГБУН «НЦБМТ ФМБА» России – питомника «Андреевка». Исследование одобрено локальным этическим Комитетом Сеченовского университета, протокол № 03-19, 13 февраля 2019 г.

В работе соблюдались положения “EU Directive for the Protection of the Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes 86/609 / EES” и принципы этики1.

Крыс содержали по 6 особей в стандартных поликарбонатных клетках объемом 16 300 см3. Все клетки были оборудованы стальными решетчатыми крышками с углублением для корма, стальными держателями этикеток, пластиковыми поилками с наконечниками. Кормление животных осуществляли с использованием сертифицированного сбалансированного гранулированного корма для грызунов (ООО «Лабораторкорм», Россия) ad libitum. Фильтрованную водопроводную воду давали ad libitum в стандартных автоклавированных питьевых бутылках со стальными наконечниками. Крысы находились в отдельных помещениях для содержания лабораторных животных в контролируемых условиях окружающей среды (20–26 °C при относительной влажности 30–70%). В комнатах содержания животных поддерживали 12-часовой цикл освещения и 10-кратную смену объема воздуха комнаты в час.

Оценка поведенческой активности крыс

Оценку актов двигательной активности проводили на приборе Laboras (Metris, Нидерланды), который представляет собой неинвазивную систему, автоматически распознающую и анализирующую такие поведенческие реакции лабораторных животных, как движение, неподвижность, вертикальная стойка, груминг, питье и прием пищи, локомоции [4]. В результате записи на приборе получаются данные по продолжительности и количеству вышеуказанных актов поведения. В нашем исследовании оценивалась двигательная активность за 15 мин.

Морфологическое исследование коры головного мозга

После записи поведенческих реакций животных усыпляли в газовой камере, осуществляли забор мозга.

Фиксацию кусочков головного мозга в жидкости Карнуа и окраску срезов осуществляли по методике, описанной нами ранее [5].

Подсчет количества и размера нейронов выполняли на микроскопе Axiolab с установленной камерой AxioCam и системой формирования изображений AxioVision (Carl Zeiss, Германия). Определение содержания нейронов в стриатуме мозга крыс с учетом возраста и пола проводили путем подсчета количества нейронов и их вертикального размера методами морфометрического анализа [6–8]. От каждого животного брали по два среза головного мозга, на которых проводили подсчет в 12 полях зрения. Идентификацию структур головного мозга крыс на соответствующих уровнях среза осуществляли по атласу G. Paxinos, C. Watson [9].

Статистический анализ

Оценку двигательной активности и подсчет количества и размера нейронов проводили в каждой из 6 групп. Нормальность распределения оценивалась с помощью критерия Колмогорова – Смирнова. Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25-й, 75-й процентили). Сравнение групп проводилось с помощью U-критерия Манна – Уитни.

Связь между признаками изучалась с использованием корреляционной зависимости, вычислялись коэффициенты корреляции и детерминации, сила связи оценивалась по шкале Чеддока. Коэффициент детерминации рассчитывался для подтверждения соответствия модели значениям полученных данных. Общие тенденции динамики изменения показателей рассчитывались в регрессионном анализе с построением тренда (линейного и полиномиального) [4]. Оценивали данные по количеству нейронов в стриатуме (12 усредненных значений) и результаты анализа двигательной активности (по 2 записи от каждого животного в группе).

Для статистической обработки данных использовали программное обеспечение: Microsoft Excel (Microsoft, США) и Origin Pro (Origin-Lab Corporation, США).

В препаратах головного мозга, окрашенных крезиловым фиолетовым по методу Ниссля, на срезах вентральной части области базальных ганглиев отмечается большое количество поперечно ориентированных в каудальном направлении нервных волокон, между которыми расположены немногочисленные скопления нейронов, преимущественно округлой формы, со слабой прокраской цитоплазмы; отростки не контурируются. Максимальное содержание нейронов отмечается у 7-месячных самцов и постепенно уменьшается в процессе старения. Количество нейронов у самок возрастает несколько раньше и в дальнейшем незначительно снижается. В срезах мозга 7-месячных особей увеличивается количество нейронов пирамидной формы с цитоплазмой, содержащей базофильные гранулы. С возрастом в стриатуме происходит снижение общего числа нейронов (рис. 1).

Определение значений количественных и размерных показателей нейронов стриатума особей различных возрастных и половых групп позволяет проследить динамику развития базальных ганглиев у крыс в ходе онтогенеза. Согласно полученным данным, нейроны характеризуются неизменными размерами для любого пола и возраста.

Полученные данные (табл.) свидетельствуют о неоднородности количества нейронов стриатума для крыс разных возрастных и половых групп. Содержание нейронов базальных ганглиев у 2-месячных особей демонстрирует количественные колебания с незначительным уменьшением числа нейронов у 7-месячных крыс у самок, в то время как у самцов 7 месяцев, напротив, наблюдалось увеличение количества нейронов. К 16 месяцам наблюдалось общее снижение количества нейронов для животных обоего пола.

Запись двигательной активности позволила охарактеризовать локомоторное поведение крыс, а также сопоставить полученные данные с количеством нейронов в участках головного мозга, ответственных за регуляцию исследуемой формы поведения, в частности, стриатума.

В ходе исследования было выявлено, что максимальной подвижностью обладали 7-месячные самцы, а минимальной – 16-месячные животные обоих полов. Аналогичная закономерность была выявлена при подсчете среднего количества нейронов в группах: наименьший показатель наблюдался у 2-месячных крыс, наибольший – у 7-месячных животных; у 16-месячных особей он снижался и был сопоставим со значениями, определенными для молодых особей.

Для определения локомоторной активности крыс были использованы результаты записи подвижности. Корреляция этого параметра и количества нейронов в области стриатума отражена в графиках (рис. 2). У особей обоего пола наблюдается высокая прямо пропорциональная зависимость в возрасте 2 месяцев, у 7-месячных крыс она снижается, доходя до минимальных значений у 16-месячных животных.

В ходе регрессионного анализа была выявлена наибольшая корреляционная зависимость между содержанием нейронов в области базальных ганглиев и двигательной активностью у 2-месячных крыс для каждого пола. Эти показатели заметно связаны и у 7-месячных животных, в то время как у 16-месячных особей наличие подобной связи прослеживается в меньшей мере и имеет U-образный вид (рис. 2).

Полученные нами данные иллюстрируют динамику изменения степени влияния морфологических и количественных характеристик стриатума на поведение животных в зависимости от возраста и пола соответствующей группы [10–13].

Базальные ганглии головного мозга представляют собой молекулярно и функционально неоднородные подкорковые структуры, участвующие в осуществлении моторных функций, принятии решений, обучении, формировании мотивации, поведения и памяти [10][14].

Стриатум – первичное входное ядро базальных ганглиев, в основном состоит из гамма-аминомасляная кислота-ергических (ГАМКергических) проекционных нейронов, называемых средними шиповатыми нейронами. Они разделены на две популяции с отдельными выходными проекционными путями, которые противоположно модулируют выходные структуры базальных ганглиев. В полосатом теле также присутствуют небольшие популяции интернейронов, в том числе холинергические интернейроны [15][16].

Стриатум получает входные данные от коры головного мозга и таламуса и отправляет выходные данные через таламус по ассоциативным и проекционным связям обратно к коре и нижележащим структурам. В области полосатого тела глутаматергический вход многих областей мозга сливается с импульсацией дофаминовых нейронов среднего мозга, что обуславливает жизненно важную роль стриатума в обучении и принятии решений [17].

Моторная кора – ключевая структура лобных отделов головного мозга, ответственная за обучение двигательным навыкам, обеспечивающая произвольную моторную активность, планирование двигательных актов и мышечную память [18–20]. Осуществление специфических функций моторной коры обусловлено ее значительной пластичностью, а также существованием тесных связей с другими областями мозга [21][22]. В частности, изучение морфолого-анатомических соединений моторной коры выявило наличие нейронной сети, связывающей моторную, премоторную кору, сенсорные области неокортекса и базальные ганглии головного мозга крыс [23][24] Именно взаимоотношениям коры и базальных ганглиев в обеспечении двигательных актов и посвящены многие из рассматриваемых работ.

Базальные ганглии тесно связаны с неокортексом (в частности, с моторной корой) через олигосинаптические петли. Сигнальные пути этих петель преимущественно сходятся в моторных областях лобной коры и в основном разделены на подкорковом уровне, что дает основание предполагать наличие функциональной взаимосвязи стриатума и моторной коры при обеспечении моторных функций [24].

Влиянию моторной коры и стриатума на моторную функцию и поведение крыс посвящено множество работ, включающих, помимо указания роли отдельных структур в регуляции активности [25][26], механизм взаимосвязи этих отделов головного мозга друг с другом. Считается, что базальные ганглии (BG – basal ganglia) совместно с другими подкорковыми структурами (так называемый BGsubcortical pathway) ответственны за выполнение стереотипных движений и врожденных форм поведения у крыс [19]. В последнее время значительно расширяются представления о роли стриатума в регуляции поведения. Так, например, доказано влияние базальных ганглиев в формировании двигательных актов крыс путем обучения методом проб и ошибок [11][19]. Что касается приобретенных двигательных навыков, то их формирование и осуществление находится под контролем моторной коры, которая осуществляет свою систему управления через таламус (за счет таламокортикальных связей) [27–29]. Имеются также данные о вовлеченности стриатума в развитие различных моторных нарушений, связанных с болезнью Паркинсона [30][31].

Многие исследователи пытаются выявить корреляционную зависимость количества нейронов в моторной коре и стриатуме с двигательной активностью у крыс разных возрастных групп. В ранее проведенном нами исследовании отмечено наличие структурно-функциональных связей между моторной корой и двигательной активностью, которая, однако, выражена в большей степени у взрослых животных. В это же время у молодых животных, сопоставив данные с полученными в настоящей работе, можно предположить наибольшую роль стриатума в обеспечении двигательного поведения [32]. Большинство статей посвящены изучению крыс с рождения и до подросткового периода, так как в этом временном интервале наблюдаются наибольшие изменения их поведения. Согласно Mengler et al. головной мозг крыс подвергается сильному росту в течение первых месяцев после рождения [33]. Это подтверждается статистической оценкой с построением кривой роста. При этом после 2 месяцев постнатального развития объем головного мозга существенно не меняется. Анализируя объемные графики коры и базальных ганглиев, приводимые в исследовании, мы можем заключить, что они показывают значительное увеличение от 3-недельного возраста до 1 месяца, непрерывный рост от 1 месяца до 2 месяцев и отсутствие существенных изменений от 2 месяцев до 3 месяцев. В стриатуме временная шкала развития, наблюдаемая при DWI (диффузновзвешенном изображении), по-видимому, согласуется с процессом миелинизации, визуализируемым при гистологическом исследовании, идентифицируя пучки волокон на срезах нервной ткани, окрашенной крезиловым фиолетовым и BGII [33]. Несмотря на активное применение иммуногистохимических методов выявления различных структур в нервной системе, классическая нейроморфология остается актуальным подходом для изучения структур центральной нервной системы [34].

Большинство исследователей сходятся во мнении, что кора и базальные ганглии в течение постнатального развития крысы находятся во взаимосвязи и определяют преобладание тех или иных форм поведения в разные возрастные периоды [23][33]. Моторная кора головного мозга крысы находится под влиянием не только периферических сенсорных афферентов и префронтальных ассоциативных областей, но и базальных ганглиев. Оценка уровня этих восходящих влияний на кору со стороны базальных ганглиев производится благодаря следующим тестам в разных возрастных группах: двигательные тесты на равновесие, навигацию по лабиринту, подъем по пандусу, а также исследование полового поведения крыс (в период полового созревания в возрасте 6–7 месяцев) [35].

Согласно результатам исследования регуляция двигательной активности, осуществляемая многими участками головного мозга, в большей степени коррелирует у молодых животных (2-мес.) с количеством нейронов в подкорковых структурах (стриатум). Вместе с тем в ходе онтогенеза наблюдается возрастание корреляционной зависимости между локомоторной деятельностью и количеством нейронов в структурах коры головного мозга [18][20][21][24]. Это подтверждает ранее полученные нами данные о роли моторной коры в обеспечении двигательного поведения у крыс в онтогенезе с учетом половых различий [32].

Количество нейронов в стриатуме подвержено половой и возрастной динамике, в то время как их размер остается неизменным в течение изучаемого нами периода. Для животных обоего пола отмечено снижение роли стриатума в обеспечении двигательной активности в процессе взросления. Эта связь максимальна у 2-месячных крыс, незначительно снижается к 7 месяцам, в дальнейшем еще более ослабевая к 16 месяцам жизни.

Описанная закономерность может быть обусловлена сложными морфофункциональными процессами реорганизации коры, наблюдаемыми у молодых особей в антенатальном онтогенезе. В результате происходящих в первый месяц постнатальной жизни перестроек структур головного мозга главенствующая роль в регуляции поведения в целом и моторной активности в частности, приходившаяся на подкорковые структуры головного мозга, перераспределяется в направлении регуляции локомоторного поведения корковыми структурами.

Г.А. Пьявченко участвовал в планировании эксперимента, его проведении. В.А. Кудрявцева и А.В. Моисеева изучили литературные источники, провели анализ данных литературы и написали введение и обсуждение статьи. С.Г. Мухамедова и С.Л. Кузнецов осуществляли общий контроль над выполнением исследования, участвовали в обсуждении полученных данных, общем редактировании текста статьи. Все авторы утвердили окончательную версию статьи.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке АО «Ретиноиды».

Благодарности. Авторы выражают благодарность проф. В.И. Ноздрину и доц. Л.И. Шмарковой за полезные обсуждения полученных данных.

Conflict of interests. The authors declare that there is no conflict of interests.

1. https://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/legislation_en.htm (дата обращения: 17.03.2020).