Развитие регенеративной медицины, направленной на восстановление пораженных патологическим процессом ткани или органа, представляет собой одно из актуальных направлений медицинской науки. Перспективным ресурсом служат мезенхимные стромальные клетки (МСК). Это гетерогенная популяция стволовых клеток с фибробластоподобной морфологией и высоким пролиферативным потенциалом. Они обладают способностью к продукции биоактивных факторов и дифференцировке в различных направлениях [1]. МСК присутствуют во многих тканях и органах (в частности, в костном мозге, жировой ткани и пуповине), локализуясь прежде всего среди периваскулярных клеток [2], и могут быть идентифицированы по адгезивности к культуральному пластику, присутствию поверхностных антигенов CD73, CD90, CD105 при отсутствии CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, CD79a или HLA-DR, а также по наличию остеогенных, адипогенных и хондрогенных потенций [3].

Согласно современным представлениям, МСК являются не только предшественниками клеток различных соединительных тканей, но и универсальными регуляторами тканевого гомеостаза. Ценность МСК для регенеративной медицины обусловлена их способностью мигрировать в зоны повреждения тканей в ответ на выделяемые последними хемотаксические стимулы [4–6] и оказывать комплексное воздействие на все стадии процесса восстановления, главным образом за счет паракринной секреции широкого набора регуляторных молекул [7]. Терапевтические эффекты трансплантации аутологичных или донорских МСК, размноженных in vitro, исследуются в многочисленных клинических испытаниях, число которых только за период с 2015 по 2021 г. превышает 400 [7]. Терапия с помощью локального или системного введения МСК демонстрирует обнадеживающие результаты при иммуноконфликтных состояниях, заболеваниях сердца, нервной системы, опорно-двигательного аппарата, почек и в ряде других случаев [2][7][8]. В частности, противовоспалительные и иммуномодулирующие свойства МСК дают надежду на их успешное применение в лечении новой коронавирусной инфекции COVID-19, что подтверждается данными ряда клинических испытаний о снижении смертности и уменьшении выраженности симптомов у пациентов с тяжелой формой заболевания при терапии этими клетками [9].

Однако не во всех случаях трансплантация МСК пациентам дает ожидаемый терапевтический эффект. Отчасти это связано с тем, что в ходе культивирования in vitro, необходимого для наращивания клеточной массы с целью последующей трансплантации, МСК подвергаются репликативному старению, снижающему не только их пролиферативный потенциал, но и способность стимулировать регенеративные процессы. Подобные изменения свойств аутологичных МСК происходят также in vivo у пожилых пациентов [10]. Другая серьезная проблема – негативное влияние патологически измененного микроокружения на выживаемость МСК. Повреждение тканей, как правило, сопровождается развитием гипоксии, окислительного стресса, выделением эндогенных токсинов и воспалительных медиаторов. В этих условиях трансплантированные МСК преждевременно гибнут, не успевая в полной мере проявить свои прорегенеративные свойства [1].

Широкомасштабное использование МСК в клинической практике требует разработки методов, в наибольшей степени обеспечивающих сохранение их жизнеспособности и терапевтической эффективности. Эта цель может быть достигнута путем прекондиционирования или генетической модификации МСК в ходе их экспансии in vitro либо путем активации эндогенных МСК пациента без необходимости их выделения, культивирования и трансплантации в условиях сопутствующих проблем и ограничений. Рассмотрение данных подходов к повышению эффективности применения МСК в регенеративной медицине является целью настоящего обзора.

Под прекондиционированием понимают различные физические или фармакологические воздействия на организм с целью повышения его устойчивости к повреждающим факторам (таким, как, например, гипоксия). Прекондиционированию могут быть подвергнуты и отдельные органы. Так, в работе Гаджиевой и соавторов [11] обработка изолированного сердца крысы креатинфосфатом перед индукцией ишемии оказывала защитное действие на сократительную способность миокарда. Применительно к клеткам прекондиционирование означает их культивирование в условиях, способствующих повышению их терапевтического потенциала при последующем введении пациенту. В случае МСК оно может быть направлено на повышение способности к миграции и адгезии, размножению и заполнению области дефекта (за счет усиления пролиферативной активности), а также на придание устойчивости к неблагоприятным условиям поврежденной ткани. Кроме того, прекондиционирование позволяет клеткам усилить секрецию цитокинов и иных регуляторных молекул и/или изменить в необходимом направлении спектр продуцируемых факторов. Эти цели могут быть достигнуты введением в состав среды гормонов, цитокинов или факторов роста, воздействием на клетки физическими факторами, культивированием в трехмерных условиях, при пониженном содержании кислорода (O2) или в присутствии бактериальных токсинов и другими способами.

Можно выделить три основные стратегии прекондиционирования МСК.

Стратегия 1. Создание наиболее физиологичных условий культивирования, воспроизводящих естественное микроокружение МСК.

Этот подход направлен на то, чтобы наилучшим образом сохранить свойства клеток, присущие им в организме и теряющиеся при культивировании в стандартных условиях. В частности, в обычной монослойной культуре не удается в полной мере воспроизвести контактные взаимодействия клеток между собой и с внеклеточным матриксом, существующие в трехмерном окружении их тканевых ниш. Культивирование МСК в виде сфероидов, в определенной степени имитирующее это окружение, приводит к усиленной экспрессии маркеров стволовых клеток [12], ангиогенных, антиапоптотических и противовоспалительных факторов [12–14], повышению устойчивости к окислительному стрессу [14] и потенций к дифференцировке [15]. В экспериментах in vivo сфероиды МСК демонстрируют более высокую способность выживать в организме реципиента [13][16] и улучшать состояние поврежденных органов [12][13][16], чем суспензии клеток из монослойных культур.

Для прекондиционирования МСК используют и различные гуморальные регуляторы их активности, в частности: основной фактор роста фибробластов (basic fibroblast growth factor, bFGF), эпидермальный фактор роста (epidermal growth factor, EGF), тромбоцитарный фактор роста (platelet-derived growth factor, PDGF), инсулиноподобный фактор роста-1 (insulin-like growth factor-1, IGF-1). Они стимулируют пролиферацию и миграцию МСК [17–19], а bFGF, кроме того, препятствует их старению in vitro [20]. Известно также, что под действием bFGF [21] и EGF [22] МСК усиленно продуцируют регуляторные молекулы, стимулирующие регенеративные процессы. После культивирования в присутствии этих факторов МСК, трансплантированные экспериментальным животным, демонстрируют повышенную терапевтическую эффективность. Например, на модели инфаркта миокарда показано усиленное функциональное восстановление сердца в случае прекондиционирования МСК PDGF [23], а также bFGF и IGF-1 [24], а МСК, обработанные EGF, эффективнее стимулировали ангиогенез и восстанавливали кровоснабжение в областях ишемии конечностей [25]. Повышение регенеративного потенциала МСК может быть достигнуто и с помощью фактора роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor, HGF), трансформирующего фактора роста-β (transforming growth factor-β, TGF-β), фактора стромального происхождения-1 (stromal cell-derived factor-1, SDF-1), мелатонина, окситоцина и др. [26].

Важной особенностью тканевого микроокружения МСК является низкое содержание O2 – от 1 до 14% [10]. Таким образом, стандартные условия культивирования при 20–21% O2 не оптимальны. Снижение содержания O2 до физиологических величин (от 1 до 5%) повышает генетическую стабильность культивируемых МСК, их пролиферативный потенциал и способствует миграции, лучшему выживанию, сохранению недифференцированного статуса, усилению продукции цитокинов и факторов роста [1][10][27–29], подавлению процессов репликативного старения [30] и снижению чувствительности к окислительному стрессу [31]. После трансплантации животным-реципиентам такие МСК лучше приживаются в патологически измененных тканях, в частности при повреждении мышц [29], ишемии нижних конечностей [27] и головного мозга [28].

Стратегия 2. Культивирование в стрессовых условиях.

В известной степени противоположный предыдущему, этот подход направлен на адаптацию МСК к неблагоприятным условиям микроокружения. Он включает культивирование в условиях жесткой гипоксии (менее 1% O2) [1], повышенной температуры (выше стандартных +37 °С) [10], дефицита сыворотки [32] или глюкозы [10], в присутствии перекиси водорода [33], бактериальных эндотоксинов [34] и провоспалительных цитокинов [35–37], воздействия ультрафиолетовым [38] или лазерным [39] излучением. Культивирование позволяет повысить устойчивость клеток к апоптозу [10, 34, 38, 40], пролиферацию [10], миграцию [38] и секреторную активность [10][33][36–40], предупредить старение [10]. Варьируя набор стрессовых условий, можно воспроизвести особенности микроокружения при конкретном заболевании и получить МСК со свойствами, необходимыми для его лечения. Так, ишемическое микроокружение с характерными тканевой гипоксией и окислительным стрессом может быть смоделировано добавлением в культуру перекиси водорода или снижением содержания O2 до 0,5% – прекондиционированные этими условиями МСК усиленно стимулируют ангиогенез при инфаркте миокарда [33, 40]. Культивирование МСК с бактериальными липополисахаридами [34] или интерфероном-γ [35], в том числе при его сочетании с интерлейкином-1ß [36] или фактором некроза опухолей альфа (tumor necrosis factor alpha, TNF-α) [37], придает клеткам противовоспалительные свойства, которые проявляются, в частности на моделях сепсиса [34] и колита [35]. При добавлении в культуральную среду экстракта поврежденной мозговой ткани МСК усиливают продукцию сигнальных молекул, стимулирующих нейрогенез и восстановление когнитивных функций у крыс с травмой головного мозга [41].

Стратегия 3. Направленное изменение характеристик МСК.

Придание клеткам необходимых свойств для повышения их эффективности в лечении тех или иных заболеваний возможно не только путем имитации in vitro патологического микроокружения, но и с помощью фармакологических агентов, воздействующих на внутриклеточные сигнальные пути. Показано, например, что прекондиционирование S-нитрозо-N-ацетилпеницилламином как донором оксида азота (NO) улучшает выживание МСК в культуре и приживление в зоне ишемии почки посредством активации внутриклеточного сигнального пути, центральными компонентами которого являются ферменты фосфоинозитид-3-киназа (phosphoinositide 3-kinase, PI3K) и протеинкиназа B (AKT) [42], а обработка клеток полирибоцитидиловой кислотой, являющейся лигандом Toll-подобного рецептора-3, через активацию пути Notch-1 повышает иммуносупрессивные свойства МСК на экспериментальной модели колита [43]. Эффект аторвастатина, повышающего терапевтическую эффективность и приживление МСК в поврежденном миокарде, связан с ингибированием сигналинга через член семейства гомологов Ras A (Ras homolog family member A, RhoA) / Rho-ассоциированную спиральную киназу (Rho-associated coiled-coil kinase, ROCK)/киназу, регулируемую внеклеточными сигналами (extracellular signal-regulated kinase, ERK) [44] и активацией NO-синтазы [45].

В тех случаях, когда прорегенеративный эффект МСК связан не только с их паракринной активностью, но и с замещением погибших клеток ткани путем дифференцировки, МСК могут быть обработаны индукторами in vitro. По некоторым данным, такие клетки демонстрируют повышенную способность к образованию костной ткани в организме реципиента [46] и заживлению дефектов хряща [47].

В экспериментальных исследованиях изучается возможность повышения и направленного изменения терапевтического потенциала МСК методами генетической инженерии. Для введения дополнительных генов в МСК могут быть использованы как векторы на основе аденовирусов, лентивирусов и ретровирусов, так и невирусные системы доставки ДНК с помощью плазмид, полимеров, липосом, методом электропорации, а также технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 [26][48]. Как и прекондиционирование, генетическая модификация повышает выживаемость МСК и способность заселять поврежденные ткани в организме пациента. МСК, трансфицированные генами, кодирующими регулятор апоптоза белок В-клеточной лимфомы-2 (B-cell lymphoma 2, Bcl-2) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor, VEGF), менее склонны к апоптозу в ишемическом микроокружении [49], а трансдуцированные геном каталазы более устойчивы к окислительному стрессу [50]. Важную роль в миграции МСК в тканевой дефект играет взаимодействие с хемокином SDF-1, усиленно продуцируемым в поврежденных тканях, через рецептор CXCR4 [5][6].

Генетическая модификация МСК позволяет повысить их регенеративный потенциал за счет усиления продукции цитокинов и факторов роста. Так, МСК, сверхэкспрессирующие CXCR4, активнее заселяют ткани реципиента и стимулируют регенерацию, в частности на моделях инфаркта миокарда [51] и воспалительных заболеваний кишечника [52]. МСК, сверхэкспрессирующие VEGF, с высокой эффективностью стимулируют ангиогенез, например в области инфаркта головного мозга [53]. Внедрение в МСК гена костного морфогенетического белка-2 (bone morphogenetic protein-2, BMP-2) усиливает остеогенные потенции как in vitro, так и in vivo на модели трансплантации в костные дефекты критического размера [54]. Ускорение регенерации костной ткани за счет стимуляции остео- и ангиогенеза показано также на примере трансплантации МСК, трансфицированных геном bFGF [55]. Повышенная терапевтическая эффективность МСК, сверхэкспрессирующих ген PDGF, была отмечена на модели остеонекроза [56], сверхэкспрессирующих ген IGF-1 – на модели остеоартрита [57], а клетки, трансфицированные геном HGF, улучшали состояние печени при циррозе [58].

Удержание трансплантированных МСК в зоне дефекта можно усилить и путем введения в них генов, контролирующих адгезию к компонентам внеклеточного матрикса, – например интегрин-связанной киназы (integrin-linked kinase, ILK) [59]. Кроме того, модифицированные МСК могут служить средством доставки в ткань материала, необходимого для коррекции генетических дефектов при наследственных заболеваниях: генов, кодирующих α1- и α2-цепи коллагена I типа COL1A1 и COL1A2, для лечения несовершенного остеогенеза [60]; гена фактора свертывания VIII для лечения гемофилии [61] и др.

Клетки, трансфицированные геном интерлейкина-10, обладают усиленной способностью подавлять иммунные реакции, в частности отторжение аллотрансплантатов роговицы [62]. Ведутся исследования применимости МСК в генной терапии онкологических заболеваний, позволяющей за счет тропности к опухолям адресно доставлять гены с противоопухолевой активностью. МСК могут быть трансфицированы генами цитокинов, усиливающих иммунный ответ, таких как интерферона-β [63], или родственного фактору некроза опухоли апоптоз-индуцирующего лиганда (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL), вызывающего гибель опухолевых клеток [64], либо ферментов бактериальной цитозиндезаминазы или вирусной тимидинкиназы, катализирующих образование цитотоксических веществ [65]. Способность генетически модифицированных МСК подавлять рост опухолей показана как in vitro [64][65], так и на экспериментальных животных [63][65]. Однако введение онкологическим пациентам МСК с иммуносупрессивными свойствами сопровождается определенным риском. Трансфекция генами цитозиндезаминазы или тимидинкиназы, продукты которых токсичны не только для клеток опухоли, но и для самих МСК, может снизить терапевтический эффект вследствие преждевременной гибели трансплантированных клеток.

В этой связи разрабатываются методы, позволяющие контролировать судьбу МСК в организме пациента путем инициации в них апоптоза. Результаты экспериментов по совместной трансфекции МСК геном TRAIL и индуцибельным геном каспазы-9, в которых клетки эффективно уничтожали агрессивный тип саркомы in vitro, свидетельствуют о том, что проапоптотические механизмы могут успешно сосуществовать с противоопухолевыми [64].

Альтернативным подходом к трансплантации аутологичных или донорских МСК, размноженных in vitro, может служить воздействие на эндогенные МСК пациента с целью их мобилизации из тканевых ниш и привлечения в пораженную область. Применение подхода, основанного на усилении способности МСК к миграции в дефекты тканей, позволяет избежать проблем, связанных с выделением и культивированием клеток in vitro, в частности снижением терапевтического потенциала в ходе пассирования.

Как известно, при повреждении тканей МСК способны выходить в системный кровоток для последующей миграции в пораженную область [6][66]. Их мобилизация из депо в периферическую кровь может быть стимулирована путем внутривенного введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF) [67][68], гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) [69], TGF-β [70], субстанции P [71], VEGF [71]. Для усиления мобилизующего эффекта ряд авторов сочетают применение этих факторов с обратимой блокировкой связывания рецептора CXCR4 на поверхности МСК с присутствующим в их тканевых нишах SDF-1. Введение ингибитора CXCR4 AMD3100 препятствует удержанию МСК в костном мозге и других депо и ведет к их более эффективному выходу в циркуляцию в ответ на G-CSF [72], VEGF [73] и другие стимулы [74].

Вместо мобилизации эндогенных МСК в кровоток или в дополнение к ней возможна также стимуляция их направленной миграции в зону поражения путем локального введения хемоаттрактантов, прежде всего SDF-1 [75–78]. Хемотаксическими стимулами для МСК могут служить также bFGF [79], TGF-β [80], а по данным исследований in vitro – EGF, IGF-1, BMP-2, -4 и -7, HGF и ряд других факторов [81]. Эти вещества могут быть введены в пораженную область путем инъекции [75][76][79] или в составе скаффолда, обеспечивающего длительное поддержание высокой местной концентрации и постепенное высвобождение [77][78][80].

Следует отметить, что вместо непосредственного введения мобилизующих или хемотаксических факторов можно стимулировать их выработку в организме пациента с помощью физических воздействий и фармакологических агентов. Так, кратковременная гипоксия, мобилизующий эффект которой связан с активацией экспрессии гена, кодирующего SDF-1, повышает содержание МСК в периферической крови [82]. Аналогичное действие оказывает и имитация гипоксии введением хлорида кобальта (в сочетании с ингибированием CXCR4) [74]. Сообщалось также о возможности мобилизации МСК в кровоток с помощью электроакупунктурного воздействия, предположительно за счет активации гипоталамуса и симпатической нервной системы [83] и привлечения их в поврежденную область путем обработки последней ультразвуком, усиливающим локальную продукцию хемоаттрактантов [84]. Стимуляцией миграции МСК через кровоток в поврежденные ткани могут быть обусловлены и прорегенеративные свойства ряда биологически активных веществ растительного происхождения, таких как каннабиноиды, протокатехиновая кислота, проантоцианидины, флавоноиды [85].

О перспективности воздействия на миграцию эндогенных МСК для стимуляции регенеративных процессов свидетельствуют результаты многочисленных экспериментальных исследований. В частности, генерализованная мобилизация МСК показала свою эффективность на: моделях болезни Альцгеймера [68], химических ожогов [71], повреждения сосудов [70], токсического поражения почек [72], переломов костей [73], разрывов сухожилий [83]; при локальном воздействии на область поражения – при инфаркте миокарда [75], костно-хрящевых дефектах [77][79][80] и повреждениях периодонта [78]; при сочетании обоих подходов – при травмах легкого [76]. Во всех упомянутых случаях улучшение состояния экспериментальных животных было достигнуто только за счет активации эндогенных МСК. Однако локальное введение хемоаттрактантов или стимуляция их продукции поврежденной тканью могут быть использованы и для улучшения заселения донорскими клетками – например, при повреждении межпозвоночных дисков [86], несращении костей [87], ишемии нижних конечностей [88]. Таким образом, воздействие на микроокружение тканей реципиента может рассматриваться как еще один, в дополнение к прекондиционированию и генетической модификации, способ повышения эффективности трансплантации МСК.

Снижение жизнеспособности и паракринной активности МСК в ходе культивирования и под влиянием неблагоприятных условий в организме пациента затрудняет их применение в регенеративной медицине. Однако в настоящее время в распоряжении исследователей имеется широкий набор методов воздействия на МСК in vitro и in vivo, позволяющих преодолеть эту проблему. Результаты многочисленных экспериментов на клеточных культурах и лабораторных животных свидетельствуют о том, что с помощью биоактивных молекул (цитокинов, хемокинов, факторов роста), фармакологических агентов, физических факторов, применения генно-инженерных технологий, изменения условий культивирования или полного исключения стадий выделения и экспансии клеток in vitro удается существенно усилить способности МСК к заселению и восстановлению патологически измененных тканей, а в ряде случаев и придать им новые терапевтические свойства, изменив секреторный профиль в требуемом направлении. Есть все основания надеяться, что продолжение подобных исследований откроет путь к широкому внедрению клеточных технологий на основе МСК в медицинскую практику.

О.В. Паюшина и Д.А. Цомартова участвовали в разработке концепции статьи и написали значительную часть текста. Е.В. Черешнева и М.Ю. Иванова подготовили введение и заключение, доработали текст рукописи. С.Г. Мухамедова и М.С. Павлова выполняли поиск, анализ и систематизацию литературы по теме обзора. С.Л. Кузнецов разработал общую концепцию статьи, руководил ее написанием и окончательно утвердил публикуемую версию. Все авторы участвовали в обсуждении и редактировании работы.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки (собственные ресурсы).

1. Xie J., Weiskirchen R. What Does the “AKT” Stand for in the Name “AKT Kinase”? Some Historical Comments. Front Oncol. 2020 Aug 11;10:1329. https://doi.org/10.3389/fonc.2020.01329. PMID: 32850422