Исследование выполнено на половозрелых 4-месячных самках вьетнамской вислобрюхой свиньи весом 20–25 кг. В течение двух недель до операции животных содержали одиночно в загоне с 12-часовым периодом чередования светлого и темного времени суток, со свободным доступом к воде и корму.

В день операции животных разделили случайным образом на две группы: интактные животные (n = 3) и мини-свиньи с контузионной ТСМ (n = 3). Премедикацию проводили с помощью внутримышечного введения 1,5 мл 2% раствора ксилазина (0,1 мл/кг), 1,5 мл раствора тилетамина и золазепама (0,1 мл/кг) и цефтриаксона (1 гр / 5 мл). После чего подопытному животному подключали ингаляционный наркоз (Minor Vet Optima, Zoomed, США) путем введения смеси 2,0–2,5% изофлурана (Laboratorios Karizoo, S.A., Испания) с кислородом. Контузионную ТСМ моделировали по протоколу, который использован нами ранее [14]. После ламинэктомии на уровне Th8–Th9 позвонков металлический цилиндр импактора фиксировали на расстоянии 1 мм от поверхности спинного мозга. Дозированную контузионную травму вызывали с помощью груза массой 50 г, падающего с высоты 50 см на участок спинного мозга, покрытого твердой мозговой оболочкой.

Забор спинного мозга у мини-свиней проводили через 2 месяца после моделирования нейротравмы. Животных выводили из эксперимента, вводя в глубокий наркоз с помощью золазепама 100 объемом 0,5 мл в/м и постепенно повышая концентрацию изофлурана до 5,0 об.% ингаляционно. Для иммунофлуоресцентного анализа выделяли каудальный отдел спинного мозга длиной 5 мм на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы, а также поясничное утолщение (L4–S2).

У интактных животных забирали идентичные области спинного мозга. Полученные образцы постфиксировали в 4% растворе параформальдегида (Sigma, США) при 4 °С в течение 12 ч, с целью криопротекции инкубировали в 30% растворе сахарозы (Sigma, США). Свободно плавающие поперечные срезы спинного мозга толщиной 20 мкм нарезали на криостате Microm HM 560. Срезы промывали в фосфатно-солевом буфере (phosphate buffered saline, PBS) с 1% Triton X-100 в течение 5 минут 3 раза, неспецифические места связывания первичных антител блокировали в PBS с 1% тритоном X-100 и 5% сывороткой осла в течение 1 часа при комнатной температуре.

Астроциты выявляли с помощью первичных антител против глиального фибриллярного кислого белка (glial fibrillary acidic protein, GFAP), олигодендроглиальные клетки с помощью антител против фактора транскрипции олигодендроцитов 2 (oligodendrocyte transcription factor 2, Olig2), клетки микроглии с помощью антител против ионизированной кальций-связывающей адаптерной молекулы 1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1, Iba1) (табл. 1). Первый этап реакции проводили при температуре 4 °С в течение 12 ч. После промывки в PBS срезы инкубировали 2 ч. при комнатной температуре с вторичными антителами, описанными в таблице 1.

Для визуализации ядер клеток срезы дополнительно окрашивали раствором 4’,6-диамидино-2фенилиндола (4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) 10 мкг/мл (Sigma, США). Цифровые изображения структур спинного мозга получали с помощью микроскопа Carl Zeiss AxioScope.A1 (Carl Zeiss, Германия) и анализировали в квадрате площадью 0,05 мм² в программе ImageJ (NIH, США). В качестве негативного контроля специфичности иммунофлуоресцентной реакции срезы спинного мозга окрашивали только вторичными антителами. Серое вещество исследовали: в передних рогах – VII, VIII, IX пластины; в задних рогах – I, II, III, IV пластины (по Рекседу). Экспрессию маркеров астроцитов (GFAP) и микроглии (Iba1) оценивали как относительную иммунопозитивную площадь, занимаемую клетками. При подсчете количества олигодендроглиальных клеток (Olig2иммунопозитивных) учитывали наличие ядер, выявляемых при помощи DAPI.

Описательные статистики представлены в виде медиан 1-го и 3-го квартилей. Для сравнения значений количественных переменных между группами применяли тест Краскела – Уоллиса. Для попарных межгрупповых сравнений использовали тест Данна, различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Статистический анализ полученных данных проводили в среде для статистических вычислений R 4.1.2 (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Австрия).

При иммунофлуоресцентном анализе площади астроцитов (GFAP-позитивных клеток) в передних рогах отдела спинного мозга, прилегающего к эпицентру травмы, у животных после ТСМ и у интактных существенной разницы не обнаружено (рис. 1А): 25,11 (21,35; 28,34)% vs. 22,59 (19,94; 25,66)%; р > 0,05. В задних рогах спинного мозга у мини-свиней после ТСМ GFAP-иммунопозитивная площадь была больше по сравнению с интактными животными: 12,53 (11,69; 13,73)% vs 6,23 (4,36; 8,73)%; p = 0,0173 (рис. 1).

При анализе количества астроцитов в поясничном утолщении в задних рогах обнаружено увеличение GFAP-позитивной площади у животных после ТСМ по сравнению с интактными животными: 19,87 (15,68; 23,70)% vs. 10,10 (9,17; 12,10)%; р = 0,002. В передних рогах эти значения у опытных и интактных животных значительно не различались и составили 23,54 (17,83; 29,59)% и 20,89 (16,18; 25,88)% соответственно; р > 0,05 (рис. 1).

Количество олигодендроцитов (Olig2-позитивных клеток) в передних и задних рогах в области эпицентра травмы в опытной группе было значительно снижено: 20,2 (20,0; 21,2) и 24,5 (22,25; 25) соответственно, по сравнению с интактной группой: 34,0 (34,0; 40,4) и 43 (40,75; 45,5) соответственно; p = 0,0002 и р < 0,0001 (рис. 2).

В поясничном утолщении количество Olig2-позитивных клеток у интактных мини-свиней составило 12 (11; 13) в передних и 16,5 (16; 20,75) в задних рогах. При этом у мини-свиней после ТСМ выявлено меньшее количество Olig2-позитивных клеток – 5 (4; 6) и 3 (2; 4,25) соответственно; р < 0,0001 и р = 0,0001 (рис. 2).

Увеличение клеток микроглии (площадь Iba1-позитивных участков) выявлено в передних и задних рогах в области эпицентра травмы у животных с ТСМ: 24,31 (22,10; 27,19)% и 30,37 (29,29; 32,43)% соответственно, при сравнении с интактными мини-свиньями: 9,87 (8,87; 10,26)% и 26,10 (23,89; 28,09)% соответственно; р = 0,0053 и р = 0,0014 (рис. 3).

Iba1-позитивная площадь, занимаемая клетками микроглии, в поясничном утолщении была больше как в передних, так и задних рогах у мини-свиней с ТСМ: 25,41 (20,50; 26,25)%; р = 0,0001 и 22,19 (14,29; 23,53)% соответственно; р = 0,0001 при сравнении с интактными животными: 9,80 (7,35; 10,61)% и 8,12 (7,58; 8,79)% соответственно (рис. 3).

Результаты нашего исследования показали, что через 2 месяца после ТСМ у мини-свиней как в каудальном отделе спинного мозга, прилегающем к эпицентру травмы, так и в удаленной области поясничного отдела происходит схожая посттравматическая реакция, проявляющаяся в увеличении площадей, занимаемых астроцитами (GFAP-позитивными клетками) и клетками микроглии (Iba1-позитивными клетками), участвующими в формировании глиального рубца, и одновременном уменьшении количества олигодендроцитов (Olig2-позитивных клеток), отвечающих за миелинизацию нервных волокон [2].

Полученные нами данные свидетельствуют о развитии хронического процесса, распространяющегося на удаленный от эпицентра ТСМ поясничный отдел спинного мозга. Анализ литературных источников также свидетельствует, что ТСМ вызывает нейровоспаление не только в эпицентре повреждения [2], но и в обширных зонах вокруг него в обоих (краниальном и каудальном) направлениях [11].

ТСМ оказывает длительное разрушительное воздействие на независимость и активность в повседневной жизни пациента, наносит физический и психологический ущерб [15]. Инвалидизация пациентов с ТСМ является значимой социально-экономической проблемой не только для пациента и членов его семьи, но и для государства. Ограниченная регенерация клеток в центральной нервной системе – ключевая проблема, которую необходимо решить при разработке новых методов лечения ТСМ. Экспериментальные подходы к посттравматическому морфофункциональному восстановлению спинного мозга первоначально разрабатываются на моделях ТСМ у животных, но они не могут быть напрямую экстраполированы на пациентов со спинномозговой травмой. Мини-свиньи по анатомическим особенностям нервной системы, физиологическим и биохимическим характеристикам приближены к человеку и считаются наиболее оптимальными животными для доклинических исследований [15].

Ремоделирование спинного мозга после ТСМ носит многогранный характер [11]. В эпицентре образуется очаг первичного повреждения с последующей активацией клеток макроглии и воспалительной инфильтрацией нейтрофилами, макрофагами, клетками резидентной микроглии [16]. Дегенерации поврежденных нервных волокон из очага ТСМ, а также проходящих через него, способствуют астроциты и микроглия, они же участвуют в реципрокной активации других нейронов [11]. В итоге происходит разрушение нервных волокон нисходящих и восходящих путей, прерывается связь между нейронами головного и спинного мозга. Воспалительный ответ подробно охарактеризован в зоне травмы [17], однако до сих пор недостаточно изучен в областях, удаленных от области повреждения [11]. При этом важность таких сведений для разработки новых методов терапии более чем очевидна.

На преодоление патогенетических и патоморфологических событий в подострой и хронической фазах ТСМ направлены такие современные стратегии лечения, как генная терапия (повышение выживаемости клеток спинного мозга, стимулирование роста аксонов, сдерживание развития нейровоспаления и предотвращение образования астроглиального рубца) и электростимуляция (содействие нейропластичности и интеграции эфферентных и афферентных сигналов, способствующих функциональному восстановлению спинного мозга). Согласно последним исследованиям, надлежит уделять внимание предотвращению патологических изменений спинного мозга не только в сегментах, прилежащих к эпицентру травмы, но и в отдаленных областях.

Большинство работ, посвященных изучению патогенетических и патоморфологических процессов при ТСМ, сфокусировано главным образом на эпицентре первичного повреждения. В настоящем исследовании нами представлены данные о реакции клеток макро- и микроглии в каудальных сегментах спинного мозга после контузионной травмы в нижнегрудном отделе у мини-свиней. Однако патологический процесс распространяется и в краниальном направлении. В этой связи требуется проведение дополнительных исследований реорганизации клеток нейроглии выше эпицентра повреждения.

Одним из аспектов последствий ТСМ является ремоделирование клеток нейроглии. Изучение патогенеза спинальной нейротравмы на мини-свиньях в нашей модели должно включать в себя исследование процессов: молекулярной перестройки внеклеточного матрикса, нейровоспаления, дегенерации и регенерации нервных проводников, реорганизации транстравматической нейронной сети и особенно вопросов нарушения и восстановления гемато-спинального барьера.

Результаты нашего исследования продемонстрировали схожую картину распределения макро- и микроглии как в сохранной нервной ткани, каудально прилегающей к эпицентру ТСМ, так и в отдаленном участке поясничного утолщения. Ремоделирование нейроглии в удаленных от места повреждения спинного мозга областях является важным процессом, который следует учитывать при разработке способов нейрорегенерации у пациентов с ТСМ.

Р.Р. Гарифулин, А.А. Измайлов, В.А. Маркосян, И.С. Минязева провели исследование и собрали материал. Р.Р. Гарифулин, А.А. Измайлов проанализировали результаты. В.В. Валиуллин, Р.Р. Исламов написали и отредактировали текст рукописи. Р.Р. Исламов – руководитель работы, разработал идею исследования, сформулировал цели и задачи и осуществлял руководство работой. Все авторы утвердили окончательную версию публикации.

Соответствие принципам этики. Исследование проведено с соблюдением положений Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей. Все манипуляции с животными проведены в соответствии с разрешением Локального этического комитета ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России (№5-26.05.2020).

Доступ к данным исследования. Данные, подтверждающие выводы этого исследования, можно получить у авторов по обоснованному запросу.

Данные и статистические методы, представленные в статье, прошли статистическое рецензирование редактором журнала – сертифицированным специалистом по биостатистике.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта РНФ № 16–15-00010.

Благодарности. Авторы выражают благодарность студентам ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет», а именно Р.Х. Ахметову, А.Р. Сираевой, К.Р. Яппаровой за помощь в проведении исследования.

1. World Health Organization. Spinal cord injury. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/spinal-cord-injury (дата обращения: 13.12.2022).