Оксид азота (nitric oxide, NO) является ключевой сигнальной молекулой, вовлеченной в функционирование различных органов и систем, в том числе в регуляцию нейротрансмиссии, вазодилатации и воспалительных реакций [1]. Синтаза оксида азота (Nitric oxide synthase, NOS), катализирующая образование NO, имеет три изоформы в зависимости от типа клеток и тканей, в состав которых она входит [2]. Нейрональная NOS (nNOS), ответственная за синтез NO нейронами, участвует в передаче сигналов нейронов, эндотелиальная NOS (eNOS) – в вазодилатации, а индуцибельная NOS (iNOS) – в иммунных ответах.

В центральной нервной системе локализованы все изоформы NOS. Синтезируемый NO участвует в регуляции кровообращения головного мозга, передачи сигнала в синапсах как ретроградный нейромедиатор и играет значимую роль во внутриклеточной передаче сигналов в нейронах – от регуляции их метаболического статуса до роста дендритных отростков. В период эмбриогенеза NO также участвует в формировании центральной и периферической нервной системы, в частности в дифференцировке нейронов, становлении синаптогенеза и церебрального кровотока [3][4].

Снижение образования NO служит главным механизмом запуска такого патологического процесса, как дисфункция эндотелия. Так, в период беременности это приводит к патологии маточно-плацентарного кровотока, нарушениям антенатального развития плода [5][6] и преэклампсии [7][8]. Тяжелый гестоз усугубляет состояние, связанное с нарушением функции плаценты, с ее васкуляризацией и часто осложняется преждевременными родами и различной патологией развития плода [9][10].

Нарушение метаболизма NO моделируется посредством введения неселективного ингибитора NO-синтазы – N(омега)-нитро-L-аргинин метилового эфира (N(omega)-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME) [11]. Применение L-NAME приводит к резкому уменьшению содержания нитрит-ионов за счет снижения экспрессии eNOS в эндотелии сосудов [2].

Применение L-NAME является широко используемой моделью экспериментальной преэклампсии [11], используется чаще всего на мышах и крысах [12]. В экспериментах при введении L-NAME беременным крысам наблюдалось развитие патологии, по своим клиническим проявлениям соответствующей гестозу: статистически значимо повышалось систолическое артериальное давление, снижалась микроциркуляция в плаценте, а также увеличивалась протеинурия [13][14]. Есть данные о неблагоприятном воздействии L-NAME на сердечно-сосудистую систему, снижении перфузии маточно-плацентарного ложа, уменьшении веса плаценты и веса потомства [15][16]. Однако влияние экспериментального ингибирования NOS в период плацентации на последующие структурные изменения нейронов в головном мозге плода изучено недостаточно.

Цель – изучить морфологические особенности нейронов коры головного мозга крысят на 20-е сутки постнатального развития в условиях введения неселективного ингибитора NO-синтазы (L-NAME) в период плацентации.

Исследование проведено на 12 беспородных белых крысах-самках одного возраста (110 ± 10 дней) из одной популяции из вивария Гродненского государственного медицинского университета массой 300 ± 20 г и их потомстве. Животных содержали в стандартных поликарбонатных клетках объемом 16 300 см³. Кормление осуществляли с использованием сертифицированного сбалансированного гранулированного корма для грызунов и фильтрованной водопроводной воды ad libitum. Крысы находились в отдельных помещениях для содержания лабораторных животных в контролируемых условиях окружающей среды (20–26 °C при относительной влажности 30–70%) с 12-часовым циклом освещения и 10-кратной сменой объема воздуха в час.

Беспородных белых самцов массой 380 ± 20 г из расчета 1 самец на 3 самки подсаживали к последним после 18.00 для оплодотворения, а выявление беременности проводили на следующий день до 9.00 утра по наличию сперматозоидов во влагалищных мазках. После оплодотворения самок содержали по 1 особи в клетке в одинаковых условиях, после родов – вместе с родившимся потомством. Для всех самок наступившая беременность была первой.

Беременных крыс опытной и контрольной групп рандомно разделили на 2 группы по 6 самок в каждой. Крысам опытной группы вводили L-NAME в дозе 25 мг/кг на 11-е сутки беременности (период плацентации) однократно внутримышечно. Доза выбрана согласно данным литературы [11]. Контрольной группе вводили 0,9% раствор NaCl однократно внутримышечно в тот же срок беременности. Роды наступали на 24 ± 2 день беременности.

После родов крысята содержались в клетках со своими матерями при вышеописанных условиях. Формирование выборки животных производилось случайным образом с исключением крысят с явными анатомическими и/или поведенческими особенностями. Взятие головного мозга осуществляли на 20-е сутки постнатального развития – в период пубертатного возраста и завершения базового синаптогенеза. Выведение крысят из эксперимента осуществлялось при помощи эфирного наркоза с последующей быстрой декапитацией. Далее извлекали головной мозг, кусочки переднего отдела коры больших полушарий фиксировали в жидкости Карнуа. Готовили серийные парафиновые срезы, которые окрашивали 0,1% толуидиновым синим по методу Ниссля [17].

Изучение гистологических препаратов, микрофотографирование, морфометрию нейронов проводили с помощью микроскопа Axioscop 2 plus (Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры Leica DFC320 (Leica Camera AG, Германия) и программы анализа изображения ImageWarp (Bitflow, США). Расположение фронтальной коры в гистологических препаратах мозга крысят определяли с помощью стереотаксического атласа [17]. У каждого животного контрольной группы оценивали не менее 30 нейронов, а экспериментальной – 150 нейронов пятого слоя коры головного мозга, что обеспечивало достаточный объем выборки для последующего анализа.

В данном исследовании были изучены размеры и форма нервных клеток (мкм²), а также выраженность их окраски толуидиновым синим [18]. С целью более точного подсчета нейронов разной степени хроматофилии цитоплазмы в фотографии гистологического препарата моделировалась сетка с ее последующим наложением на фото изучаемой области головного мозга в программе Microsoft Word (Microsoft Office, США). Сетка представляет собой таблицу, соответствующую размеру полученного изображения (123×165 мм), с десятью равными ячейками размером 24,7×33,0 мм. Во всех ячейках сетки, соответствующей площади участка гистологического препарата с учетом увеличения микроскопа, осуществлялся подсчет нейронов разной степени хроматофилии цитоплазмы (нормохромные, гипохромные, гиперхромные, гиперхромные сморщенные) с последующим определением их процентного содержания к общему количеству нейронов в сетке или абсолютного количества на 1 мм².

Для изучения размеров и формы перикарионов измеряли площадь, фактор элонгации (отношение максимального и минимального диаметров) и формфактор (отношение 4-х площадей к периметру в квадрате) в условных единицах. Для наглядного отображения формы нейронов коры головного мозга использовался шаблон геометрической фигуры овала в программе Microsoft Word (Microsoft Office, США) с указанием параметров «ширина» – Ш и «высота» – В. Параметры овала задавались в окне свойств фигуры «Размер» пропорционально геометрическим размерам нейронов.

Представленная работа является продолжением опубликованной нами ранее работы [19], в которой мы изучали эти же параметры у новорожденных крысят в аналогичных условиях.

В результате гистологических исследований получены количественные непрерывные данные, которые обрабатывали с помощью программы Statistica 13.0 (TIBCO, США). Так как в эксперименте использованы малые выборки, которые имели ненормальное распределение, анализ проводили методами непараметрической статистики. Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25-й; 75-й процентили) [20]. Для сравнения групп применялся критерий Манна – Уитни, критерий хи-квадрат Пирсона. Различия между показателями считали статистически значимыми при р < 0,05.

При изучении плотности расположения нейронов на 1 мм² фронтальной коры головного мозга у двадцатисуточных крысят была выявлена тенденция к уменьшению на 10% количества клеток у потомства, рожденного самками с пренатальным введением L-NAME, в сравнении с контрольной группой (p > 0,05).

Также в опытной группе выявлена тенденция к уменьшению площади нейронов на 22% (разница между группами не значима) и изменение формы перикарионов в сторону их большей вытянутости за счет статистически значимого увеличения фактора элонгации на 0,3 ед., в то время как форм-фактор не изменялся (табл.).

У двадцатисуточных крысят контрольной группы в пятом слое фронтальной коры головного мозга преобладали нормохромные нейроны (рис. 1).

Доли нейронов с различной выраженностью окраски статистически значимо различались в исследованных группах. В опытной группе животных, рожденных самками с пренатальным введением L-NAME, отмечалось уменьшение доли нормохромных нейронов до 80% (по сравнению с 95% в контрольной), шестикратное увеличение доли гиперхромных нейронов, появление гиперхромных сморщенных нейронов. По долям гипохромных нейронов группы не различались (рис. 2).

Введение L-NAME – неселективного ингибитора NO-синтазы на 11-е сутки беременности (период плацентации) приводило у двадцатисуточных крысят опытной группы к уменьшению доли нормохромных нейронов, увеличению доли гиперхромных нейронов и появлению гиперхромных сморщенных нейронов, отсутствовавших у крысят контрольной группы. Также при введении L-NAME отмечалась тенденция к снижению плотности расположения нейронов в пятом слое коры головного мозга, форма изменялась из круглой на вытянутую. Данный эффект при введении L-NAME может быть обусловлен снижением образования NO как в нейронах, так и в эндотелии сосудов, что ведет к нарушению клеточного метаболизма, вазодилататорных компенсаторных механизмов с развитием ишемии и водно-электролитного дисбаланса, в порочном круге усугубляющих деформацию тел нейронов и их сморщивание [21][22].

В нашей предыдущей работе [19], выполненной на новорожденных крысятах, рожденных в аналогичных условиях, в группе после введения L-NAME фактор элонгации был равен 1,24 (1,21; 1,30) ед., форм-фактор 0,87 (0,81; 0,88), доля нормохромных нейронов составила 95%, гипохромных и гиперхромных – по 2,5%, гиперхромных сморщенных нейронов не было выявлено. Полученные данные в представленной работе могут свидетельствовать о развитии и прогрессировании постнатальных изменений в центральной нервной системе крысят, подвергнутых введению неселективного ингибитора NO-синтазы в период плацентации.

Предполагается, что интенсивная окраска цитоплазмы нейронов характеризует преобладание образования белка над его утилизацией. Некоторые исследователи расценивают гиперхромные нейроны как гиперфункциональные и считают, что синтезированный ими белок идет на их собственные потребности [23]. Хотя многие авторы изучали гиперхромные нейроны, тем не менее сведения о них весьма противоречивы и вынести по ним суждение о сущности и функциональном значении данного явления довольно трудно [23][24].

Существует мнение, согласно которому появление гиперхромных и гиперхромных сморщенных нейронов связано со снижением их функциональной активности и отражает происходящие в них процессы торможения. Подтверждением низкой функциональной активности гиперхромных сморщенных нейронов служат описываемые в литературе результаты электронно-микроскопического и ауторадиографического исследования, показывающие двукратное снижение скорости выведения вновь синтезированной рибонуклеиновой кислоты из ядра в цитоплазму клетки [22]. Описанные в литературе данные об электронной микроскопии гиперхромных несморщенных нейронов свидетельствуют о содержании большого количества канальцев гранулярной эндоплазматической сети в описанных клетках [24]. Также, в них повышено и количество свободных рибосом. В то же время гиперхромные нейроны имеют меньшее число митохондрий по сравнению с нормохромными. Ядра и цитоплазма гиперхромных сморщенных нейронов темные и покрыты многочисленными складками. Для данного типа нейронов характерны дезорганизация и деструктивные изменения органелл, наблюдается значительное расширение канальцев гранулярной эндоплазматической сети и комплекса Гольджи, свободные рибосомы образуют поля и скопления, отмечается набухание митохондрий и деградация их крист [23].

Введение крысам в период плацентации неселективного ингибитора NO-синтазы L-NAME приводит к морфологическим нарушениям нейронов фронтальной коры головного мозга крысят, проявляющимся в пубертатном возрасте уменьшением размеров клеток, увеличением доли гиперхромных и появлением гиперхромных сморщенных нейронов наряду с уменьшением доли нормохромных нейронов, что, по всей видимости, является следствием снижения образования оксида азота как в самих нейронах, так и в эндотелии сосудов, питающих головной мозг.

Н.Е. Максимович внесла основной вклад в разработку концепции и дизайна исследования, руководила процессом написания статьи. Т.С. Русак, Е.И. Бонь провели эксперимент с животными, статистическую обработку данных и редактирование статьи. А.Д. Бернацкая, А.С. Кусмарцева внесли вклад в поиск литературных источников, а также подготовили иллюстрации. Все авторы одобрили окончательный вариант статьи и готовы взять на себя ответственность за все аспекты представленной публикации.

Соответствие принципам этики. Исследование проведено с соблюдением положений Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей. Все манипуляции с животными проведены в соответствии с разрешением Локального этического комитета УО «Гродненский государственный медицинский университет» (№ 6-03.11.2022).

Доступ к данным исследования. Данные, подтверждающие выводы этого исследования, можно получить у авторов по обоснованному запросу.

Данные и статистические методы, представленные в статье, прошли статистическое рецензирование редактором журнала – сертифицированным специалистом по биостатистике.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки (собственные ресурсы).