Изучение влияния концентрации натрий-карбоксиметилцеллюлозы на кровоостанавливающую и противоспаечную активность при операциях на печени в эксперименте

Практически все операции на печени сопряжены с риском диффузного, плохо контролируемого крово­течения [1][2][3][4][5] и его отдаленных последствий, одним из которых является спаечная болезнь на фоне гемобилиарного перитонита [6][7]. Повреждение даже одного листка брюшины может спровоцировать ка­пиллярное кровотечение с образованием фибрина в качестве склеивающего фактора [8]. Ситуация усу­губляется дальнейшим развитием васкуляризованной соединительной ткани в составе фибриновой стяжки и недостаточной активностью системы фибринолиза.

По этой причине одной из важнейших иссле­довательских задач является разработка методов и средств эффективного гемостаза, способных пре­дупредить возникновение возможных осложнений, включая спаечный процесс.

В качестве противоспаечного средства рядом авторов предлагается 4% водный гель натрий-карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ), разрешенный к применению под торговой маркой «Мезогель» (ООО «Линтекс», г. Санкт-Петербург) [9]. Этот пре­парат успешно применяется для профилактики спа­ечной болезни в абдоминальной хирургии [10].

Основой «Мезогеля» служит Na-КМЦ, которая представляет собой полимерную структуру с общей формулой ([С₆Н₇О₂(ОН)_3-x(OCH₂COONa)_x]_n, где x = 0,02-1,50). Достоинствами этого препарата являются отсутствие раздражающего и сенсибилизирующе­го действия, сравнительно низкая бактериоемкость и достаточно высокая осмотическая активность [11]. Na-КМЦ образует эластичные набухающие гели, объемы которых могут в десятки раз превосходить собственный объем полимера. Нити полимера распо­лагаются параллельно друг другу, расстояние между ними пропорционально концентрации геля: чем она выше, тем последнее меньше, также расположен­ные более перпендикулярно гидроксильные группы способствуют образованию «решетки», которая за­держивает форменные элементы крови, в том числе тромбоциты, образуя матрицу для формирования сгустка крови. С другой стороны, жидкая часть кро­ви — плазма — абсорбируется, способствуя набуха­нию геля. Этот эффект зависит от степени замеще­ния, полимеризации и степени нейтрализации кар­боксильных групп [12][13][14]. Концентрация геля вли­яет на способность Na-КМЦ абсорбировать и удер­живать воду. Эти данные натолкнули нас на мысль об усилении кровоостанавливающего эффекта пре­парата за счет увеличения концентрации геля.

Целью нашего исследования стало определение концентрации Na-КМЦ, обладающей максимальным гемостатическим эффектом, а также сохраняющей противоспаечную активность при операциях на пе­чени в эксперименте.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование одобрено региональным этическим комитетом при Курском государственном медицин­ском университете (КГМУ), протокол № 2/2013.

В работе использовали растворы (0,5-2%) и гели (3%, от 5 до 9%) Na-КМЦ (ООО «Линтекс», г. Санкт- Петербург) с массовой долей 0,5-9%, которые гото­вили на бидистилляте воды, пропущенной предвари­тельно через катионит КУ 1 для снижения степени ионного обмена. Помимо этого, использовали противоспаечный, рассасывающийся 4% гель Na-КМЦ («Мезогель», ООО «Линтекс», г. Санкт-Петербург). Нативную кровь получали с письменного согласия 10 доноров-добровольцев мужского пола в возрасте 20 лет без соматических заболеваний согласно ГОСТ Р 52623.0-2006 «Технология выполнения простых медицинских услуг». Осуществляли забор венозной крови по 5 мл.

Эксперимент in vitro

Эксперимент in vivo

Оценка кровоостанавливающего эффекта in vivo выполнена на лабораторных животных — 167 кры- сах-самцах линии Wistar массой 185-250 г. Животные находились в виварии с соблюдением стандартных условий пребывания и режима кормления. Экспери­менты проведены в соответствии с ГОСТ 33215-2014 «Правила оборудования помещений и организации процедур при работе с лабораторными животными; ГОСТ 33216-2014 «Правила работы с лабораторны­ми грызунами и кроликами»; «Методические реко­мендации по содержанию лабораторных животных в вивариях научно-исследовательских институтов и учебных заведений» РД-АПК 3.10.07.02-09 и с ре­комендациями Международного комитета по науке о лабораторных животных, поддержанными ВОЗ, директивой Европейского парламента № 2010/63/EU от 22.09.10 «О защите животных, используемых для научных целей»; Европейской конвенцией по за­щите позвоночных животных, используемых для экс­периментов или в иных научных целях (Страсбург, 18.03.1986).

В остром опыте под масочным изофлурановым наркозом крысам выполняли срединную лапарото- мию. Под левую долю печени подкладывали мар­левую салфетку с заведомо известной массой и от­граничивали пропитывание последней жидкостью, продуцируемой брюшиной, с помощью полиэтиле­новой пленки. Затем моделировали рану печени пу­тем отсечения края органа стандартным способом, прикладывая трафарет в виде угольника, длина ребер которого была равна 1 см; высота раны составляла 3 мм. Такой характер операционной раны выбран для повреждения не только поверхностных капилля­ров, но и крупных кровеносных сосудов и долевых желчных протоков, находящихся в толще паренхимы органа, с целью моделирования массивного кровоте­чения и желчеистечения.

После этого на кровоточащую область раны на­носили исследуемые материалы: 1 мл геля Na-КМЦ концентраций, отобранных по результатам экспери­мента in vitro (3, 4, 5, 6, 7 и 8%), в пропорции 1:2 (площадь раневой поверхности к объему апплицируемого геля). В каждой из 6 опытных групп для изу­ченных концентраций Na-КМЦ было по 20 живот­ных. В группе контроля (n = 20) моделировалась рана печени аналогично опытным группам, крово­останавливающие средства не применялись.

После моделирования раны включали секундо­мер и останавливали его после полного прекращения кровотечения, которое определялось как отсутствие выделения крови или истечения ее из-под опытных образцов геля Na-КМЦ. Регистрировали время оста­новки кровотечения и величину кровопотери, кото­рую определяли как разницу веса марлевой салфетки до эксперимента и после его окончания (пропитыва­ния кровью).

В хроническом эксперименте определяли проти- воспаечную активность наиболее эффективного об­разца геля Na-КМЦ. Для этого у 27 крыс произведе­но моделирование раны печени без ее последующего ушивания, с аппликацией кровоостанавливающих средств, как описано выше. Из каждой группы: кон­трольной, без применения опытных образцов геля Na-КМЦ (n = 9) и двух опытных, с применением геля Na-КМЦ 4% («Мезогель») (n = 9) и Na-КМЦ 6% (n = 9) выводили из эксперимента по 3 животных путем подачи в кувез углекислого газа на 3, 7 и 14-е сутки.

Выраженность спаечного процесса оценивали с помощью метода семантического дифференциа­ла, разработанного на кафедре оперативной хирур­гии и топографической анатомии КГМУ в 2004 г.

Липатовым В.А. [15], который по данным литературы выделил значимые виды спаек, типы их распростране­ния, наличие деформации внутренних органов сраще­ниями и разработал иерархическую структуру оценки образования спаек. Далее Липатовым В.А. было про­ведено анкетирование экспертов (врачей-хирургов), в котором предлагалось выстроить в логической по­следовательности три группы факторов согласно воз­растанию значимости в формировании спаечного про­цесса. На основе результатов обработки анкет с по­мощью методов ранжирования и факторного анализа определены коэффициенты значимости (КЗ) для раз­личных показателей внутрибрюшных спаек.

В нашем исследовании внутрибрюшинные спай­ки оценивали в баллах от 0 до 5 с последующим ум­ножением на КЗ: распространенность спаечного про­цесса (КЗ = 0,455), деформация органов, вовлечен­ных в процесс образования спаек (КЗ = 0,338), вы­раженность различных видов спаек, таких как саль­никовые (КЗ = 0,015), плоскостные (КЗ = 0,066), перепончатые (КЗ = 0,046), тракционные (КЗ = 0,45), шнуровидные (КЗ = 0,031). Комплексная оценка вы­раженности спаечного процесса получается из сло­жения оценок всех единичных качеств в каждом кон­кретном случае.

Статистический анализ

Полученные данные представлены в виде средне­го значения и ошибки среднего, для хронического экс­перимента данные представлены как медиана и меж- квартильный размах (Me, 25-й и 75-й процентили). Для проверки статистических гипотез использован критерий Манна — Уитни. Для изучения связи между признаками использовался коэффициент корреляции Пирсона. Различия считали значимыми прир < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Эксперимент in vitro

При добавлении к Na-КМЦ различных концентра­ций 0,5 мл крови наблюдалось образование сгустка, что свидетельствовало о коагуляции крови. Однако при дальнейшем добавлении к гелю воды в объеме, достаточном для превращения геля в раствор, про­исходил один из трех вариантов изменения сгустка: он растворялся, его площадь значимо не менялась или увеличивалась (табл.). Это свидетельствова­ло о наличии истинного коагулирующего эффекта не у всех концентраций Na-КМЦ

Для 0,5, 1,5 и 2% растворов Na-КМЦ площадь, окрашенная кровью, значительно увеличивалась после добавления воды и занимала всю площадь дна стакана. Это свидетельствовало об образовании псевдосгустка (рис. 1А, Б).

При добавлении дистиллированной воды к 3 и 4% гелю Na-КМЦ площадь сгустка статистически зна­чимо увеличилась, при этом полного растворения не наступило (рис. 1В, Г). Добавление воды к 5 и 6% гелю Na-КМЦ практически не изменяло площадь сгустка. (рис. 1Д, Е).

После добавления дистиллированной воды к 7% гелю Na-КМЦ площадь сгустка увеличилась в 2,7 раза (р < 0,01). При добавлении крови к 8 и 9% образцам, представляющим собой густой же­леобразный концентрат, не имеющий гелеобразной формы, который с трудом распределялся по дну гра­дуированного стакана, кровь растекалась на поверх­ности. После добавления воды происходило то же самое. Различия площади сгустка были значимыми (р < 0,01), что свидетельствовало об отсутствии гемостатических свойств.

Острый эксперимент in vivo Анализ времени остановки кровотечения пока­зал, что все изучаемые образцы статистически зна­чимо снижали данную величину относительно кон­трольной группы (рис. 2). Наиболее выраженный эффект отмечен у Na-КМЦ 6%, который уменьшал время кровотечения на 46%; далее по степени убы­вания эффекта следовали: Na-КМЦ 5% — уменьшал время кровотечения на 40%, Na-КМЦ 4% — на 37%, Na-КМЦ 3% — на 29%, Na-КМЦ 7% — на 27% и Na- КМЦ 8% — на 11%.

Величина кровопотери снижалась в изученных образцах сходным образом (рис. 3): наибольший эффект отмечен у Na-КМЦ 6%, для которого сниже­ние кровопотери относительно группы контроля со­ставило 27%; далее по степени убывания эффекта: Na-КМЦ 5% — уменьшение кровопотери на 21%, Na-КМЦ 4% — на 14%, Na-КМЦ 7% — на 12%, Na-КМЦ 3% — на 11% и Na-КМЦ 8% — на 5%. При сравнении всех исследованных концентраций геля Na-КМЦ с группой контроля по времени крово­течения и величине кровопотери различия статисти­чески значимы: р < 0,01.

Отмечалась сильная обратная линейная связь меж­ду концентрациями от 3 до 6% Na-КМЦ и указанны­ми величинами: коэффициент корреляции Пирсона для времени кровотечения составил -0,952 (р < 0,01), для объема кровопотери — 0,956 (р < 0,01).

Хронический эксперимент in vivo

Анализ данных хронического эксперимента по­казал, что при вскрытии животных, выведенных из эксперимента на 3-и сутки, спаечный процесс в контрольной группе оценен в 1,898 [1,433-2,237] балла; выявлены сальниковые и плоскостные спай­ки, подходящие к краю послеоперационной раны, ограниченные областью манипуляции, без види­мой деформации внутренних органов. В двух груп­пах исследования опытных образцов Na-КМЦ: 4% («Мезогель») и 6% концентраций спаечный процесс полностью отсутствовал — не выявлено спаек, край послеоперационной раны был покрыт нежным на­летом фибрина, отсутствовали изменения соседних органов и выпот в брюшной полости.

У животных контрольной группы, выведенных из эксперимента на 7-е сутки, спаечный процесс оценен в 2,457 [2,118-2,457] балла. В группах при­менения Na-КМЦ 4% («Мезогель») и 6% на 7-е сутки спаечный процесс оценен в 0 [0,000-0,497] и 0,497 [0,000-0,497] балла соответственно (разница при по­парном сравнении с контролем статистически зна­чима, р < 0,01); выявлены единичные сальниковые спайки, подходящие к краю послеоперационной раны, не деформировавшие последний, без вовлече­ния в процесс синтопичных органов.

При вскрытии животных, выведенных из экспери­мента на 14-е сутки, спаечный процесс в исследуемых группах оценен для Na-КМЦ 4% («Мезогель») в 0,960 [0,000-0,962] балла; Na-КМЦ 6% — 0,962 [0,000­1,301] балла. Увеличение данного показателя связано с увеличением частоты выявления спаек, однако их характер — сальниковые — и отсутствие деформации внутренних органов остались прежними. Спаечный процесс в контрольной группе значимо прогресси­ровал, он составил 4,071 [3,758-4,602] балла. Изме­нился как характер выявленных спаек: преобладали тракционные, шнуровидные спайки, также присут­ствовали сальниковые и плоскостные, так и распро­страненность спаечного процесса, последний занимал всю брюшную полость. Была выражена деформация внутренних органов, вовлеченных в спаечный про­цесс: краев послеоперационной раны печени, желуд­ка, отмечали сужение просвета кишечника. Выявлено статистически значимое различие между контролем и каждой из исследуемых групп (р < 0,01).

ОБСУЖДЕНИЕ

В эксперименте in vitro растворы Na-КМЦ кон­центраций 0,5; 1,5 и 2% не обладали коагулирующим эффектом; он появлялся у гелей начиная с 3% кон­центрации и достигал максимума к 6%. Это объясня­ется тем, что расстояние между фибриллами полиме­ра становится меньше, также возрастает сила поля­ризации поперечных гидроксильных групп. С одной стороны, это способствует формированию решетки, на которой задерживаются форменные элементы, и наступлению условий для формирования кровяно­го сгустка, с другой стороны — усиливается процесс полимеризации, который усиливает набухание геля за счет абсорбции жидкой части крови — плазмы — полимером.

В ходе острого опыта мы наблюдали четкую U-образную связь между концентрацией Na-КМЦ и изучаемыми величинами: временем кровотечения и величиной кровопотери. Это подтвердило ранее заявленный механизм гемостатического эффек­та в опыте in vitro и выявленную закономерность: увеличение эффекта от концентрации Na-КМЦ 3% до 6% и дальнейшее его уменьшение с 7-8%. Его спад можно также объяснить тем, что условия экспе­римента, которые максимально приближены к усло­виям настоящей операции у человека, не способству­ют увеличению гемостатических свойств образцов Na-КМЦ 7-8% по сравнению с опытом in vitro, так как время растворения (набухания) геля практически равно времени остановки кровотечения без примене­ния гемостатиков. В условиях настоящей операции на печени у человека выдерживать такую экспози­цию не предоставляется возможным и является даже опасным.

Температурный режим также не способствует бо­лее быстрому растворению образцов. Он был увели­чен, по сравнению с опытом in vitro, для приближения к условиям реальной операции. Температура тела здо­рового животного (крысы) 38,5-39,5 °С; температура тела пациента, как здорового, так и с гипертермией, лежит в диапазоне 36,6-41 °С, а гель непосредствен­но контактирует с поверхностью резецированного края печени. Согласно данным Йулдошова Ш.А. [16], увеличение температуры не приводит к увеличению скорости растворения (набухания) гелей Na-КМЦ. Данные образцы являются непригодными для приме­нения в рамках практической медицины.

Как видно из эксперимента, время кровотечения сокращалось более выраженно, чем величина крово- потери. Например, для геля 6% №-КМЦ эти показа­тели составили 46 и 27% соответственно. Это можно объяснить условиями эксперимента, когда, в отличие от искусственных моделей, из поврежденного сосу­дистого русла вытекает разный объем крови за еди­ницу времени. Это обусловлено включением каска­да системы гемостаза после нанесения операцион­ной раны, причем как сосудисто-тромбоцитарного (местного), так и коагуляционного (системного), так как характер раны моделирует процесс как паренхи­матозного, так и кровотечения из крупных долевых сосудов печени. Вначале (момент нанесения раны) будет истекать максимальный объем крови, затем при подключении факторов гемостаза (сокращения стенок сосудов, образования тромбоцитарной проб­ки, что способствует остановке кровотечения из мел­ких капилляров) объем крови уменьшится. Парал­лельно с этим начинает работать система коагуля­ционного гемостаза, отвечающая за остановку кро­вотечения в крупных сосудах: начало необратимой агрегации тромбоцитов и запуск образования фибри­на на поверхности тромбоцитов, приводящие к об­разованию тромба, под действием тромбина плазмы на фибриноген, что еще больше сокращает величину кровопотери. Однако если повреждены крупные со­суды и не произведены меры по остановке кровоте­чения, тромб может оторваться, и объем излившейся крови вновь увеличится [17]. Это, в свою очередь, влияет в каждую конкретную секунду на объем кро­вопотери. Именно поэтому мы не наблюдали про­порциональной зависимости в уменьшении времени и величины кровопотери. Также гель Ка-КМЦ пред­ставляет собой местный гемостатик, и он не оказы­вает системного действия и не регулирует скорость гемостаза на каждом этапе.

Данные хронического эксперимента показали, что противоспаечная активность геля 6% Na-КМЦ не уступает барьерной функции «Мезогеля», в ходе опыта не выявлено значимых различий между группа­ми. Однако относительно контрольной группы данные препараты являются высокоэффективными (р < 0,01).

При анализе результатов аналогичных исследова­ний мы пришли к выводу, что по противоспаечной активности 6% гель Na-КМЦ значительно превос­ходит такие препараты, как губка гемостатическая «Белкозин» (г. Луга); гемостатические средства, со­держащие окисленную регенерированную целлюло­зу Surgicel и Surgicel Nu-knit (производство Johnson & Johnson, США). По данным Майстренко А.Н. [18], при их применении коэффициент выраженности спа­ечного процесса составил 3,168 ± 0,16, 2,171 ± 0,32 и 2,424 ± 0,17 балла соответственно. Вместе с этим, гемостатические свойства 6% геля Na-КМЦ были ниже, чем у гемостатической губки «Белкозин» (г. Луга), «Зеленая дубрава» (г. Москва), губки гемо- статической с транексамовой кислотой 9% и гемо­блоком (производство «Зеленая дубрава», г. Москва): эти препараты снижали время остановки кровотече­ния и величину кровопотери по сравнению с контро­лем более чем на 51% [19].

В работе Давыденко В.В. [20] установлено укоро­чение времени остановки кровотечения при травме печени на 30% для нового гемостатического средства на основе хитозана «Гемофлекс Про» (ООО «Инмед», РФ), на 40% — для гемостатической пластины на основе прокоагулянтов животного и человеческо­го происхождения «TachoComb» (Nycomed Austria GmbH, Австрия), на 55% для препарата «Surgicel Nu-knit» (Johnson & Johnson, США), на 60% — для «CeloxТМ Gauze Hemostat» — гемостатического средства на основе хитозана (MedTrade Products Ltd, Великобритания). В нашем исследовании 6% гель Na-КМЦ уступал в эффективности последним двум образцам: время остановки кровотечения относи­тельно контроля сокращалось на 46%.

В цитированном выше исследовании не выявле­но прямой взаимосвязи между временем остановки кровотечения и величиной кровопотери, более вы- раженно сокращался второй показатель. Уменьше­ние величины кровопотери относительно контроль­ной группы при использовании «Surgicel Nu-knit» и «CeloxТМ Gauze Hemostat» происходило на 88%, «TachoComb» — на 82%, «Гемофлекс Про» — на 51%, что существенно выше, чем при использовании 6% геля Na-КМЦ в нашем исследовании. Такие раз­личия можно объяснить разницей в степени пористо­сти структуры применяемых образцов, что могло су­щественно повлиять на объем абсорбируемой крови самими гемостатическими средствами, изученными в работе Давыденко В.В. [20]

Что касается противоспаечной активности, при вскрытии животных на 7-е сутки с использова­нием всех образцов выявлены: «небольшое коли­чество рыхлых спаек в зоне аппликации гемостатического средства; а на 30-е сутки — выраженные плотные спайки в зоне аппликации гемостатического средства, данный вид спаек выявлен и в контрольной группе» [20]. В данном случае 6%-ный гель Na-КМЦ значительно снижает развитие спаечного процесса в брюшной полости в отличие от оппонентов.

В исследовании Мельновой Н.И. [21] по изуче­нию эффективности нового средства «Гамастат» на основе неорганических солей (полный состав не раскрывается) и «Вискостата» — гемостатического геля с 25%-ным содержанием хлорида алю­миния (Ultradent, США) выявлено уменьшение показателя времени остановки кровотечения на 80 и 84% соответственно, однако в тексте статьи есть существенное примечание: «в единичных случаях «Гамастат» наносили повторно, при этом оконча­тельный гемостаз наступал через 6-8 минут». Это время значительно превосходило время остановки кровотечения в контрольной группе (1712,5 ± 242,4 с). «В случаях когда остановка кровотечения была неполной и из-под краев пленки просачивалась кровь, “Вискостат” наносили повторно. При этом окончательный гемостаз наступал через 10-11 ми­нут» [21]. В ходе всего эксперимента гемостаз в ис­следуемых группах Na-КМЦ был всегда окончатель­ным и не превышал время в контрольной группе.

Величина кровопотери уменьшалась при примене­нии «Вискостата» на 25% и «Гамастата» — на 47% процентов относительно контрольной группы. 6% Na-КМЦ не уступает своему гелевому аналогу и яв­ляется более эффективным, уменьшение показателя происходило на 27%. Оценка спаечного процесса авторами не производилась.

В дальнейшем для совершенствования наиболее эффективного образца — геля Na-КМЦ 6% — воз­можно произвести увеличение гомеостатических свойств за счет дополнительных механизмов, напри­мер введения усиливающей компоненты, с целью конкурентоспособности данного материала и приме­нения его в абдоминальной хирургии при операциях на печени в качестве комбинированного средства.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Кровоостанавливающий эффект геля Na-КМЦ не имеет прямой зависимости от концентрации, уве­личение показателя отмечается в диапазоне 3-6%, за­тем наступает регресс и полное отсутствие данного эффекта у препаратов с концентрацией от 7 до 9%. Максимальным гемостатическим и противоспаечным эффектом обладает гель Na-КМЦ 6%.