Цитокиновый профиль зубодесневой жидкости у детей с нарушением системы иммунологического надзора

Список сокращений:

• GBI – gingival bleeding index, индекс кровоточивости десны
• GI – gingival index score, десневой индекс
• IL-10 – interleukin-10, интерлейкин 10
• IL-1RA – interleukin-1 receptor antagonist, антагонист рецептора интерлейкина 1
• IL-1β – interleukin-1β, интерлейкин 1 бета
• IL-18 – interleukin-18, интерлейкин 18
• MCP-1 – monocyte chemoattractant protein-1, моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1
• OHI-S – oral hygiene indices – simplified, упрощенный индекс гигиены полости рта
• VEGF – vascular endothelial growth factor, васкулоэндотелиальный фактор роста
• ГИБТ – генно-инженерная биологическая терапия
• ЗДЖ – зубодесневая жидкость / GCF – gingival crevicular fluid
• КПУ – кариес, пломба, удаленный зуб / DMF – decayed, missing, filled index
• НПВП – нестероидные противовоспалительные препараты
• РА – ревматоидный артрит
• ЮРА – ювенильный ревматоидный артрит

Современные исследования свойств и молекулярного состава зубодесневой жидкости (ЗДЖ) при воспалительных заболеваниях пародонта позволили сформулировать цитокиновую концепцию развития этого патологического процесса [1–3]. В рамках данной концепции установлено, что пародонто-патогенные бактерии индуцируют усиление продукции провоспалительных цитокинов активированными моноцитами и макрофагами, что приводит к дисбалансу между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами. Исходом каскадных межклеточных взаимодействий, регулируемых цитокинами, является активация остеокластов и резорбция костной ткани [4]. Установлено, что активация иммунного ответа на Th1-тип реагирования и снижение функциональной активности B-лимфоцитов обуславливают увеличение концентрации провоспалительных цитокинов в ЗДЖ [5].

Цитокины представляют собой малые белковые молекулы, которые секретируются различными клетками системы иммунологического надзора [6]. Они осуществляют коммуникацию между клетками, стимулируют их деление, функциональную активность и апоптоз [7]. Цитокины играют ведущую в роль в координации работы врожденного и адаптивного иммунитета. Количество и тип цитокинов, секретируемых клетками, различаются в зависимости от типа патогена, что способствует адаптации иммунной системы к ответу и определяет, будет ли он врожденным или адаптивным.

Если имеет место сбалансированность между местной стимуляцией и умеренным иммунным ответом, то доминирует иммунологический надзор и соответствующий иммунный ответ [8]. При повышении уровня колонизации ключевыми пародонтогенными бактериями происходит чрезмерная активация иммунного ответа и разрушение тканей [9].

К основным цитокинам, участвующим в воспалительной реакции и воздействующим на костную ткань, относят IL-1β (interleukin-1β, интерлейкин 1 бета). Другим важным цитокином, участвующим в развитии иммунопатологического процесса, является IL-18 (interleukin-18, интерлейкин 18), который регулирует Т-хелперный тип иммунной реакции, усиливает синтез других провоспалительных цитокинов [10], в частности MCP-1 (мonocyte chemoattractant protein-1, моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1), который регулирует процесс миграции и инфильтрации макрофагов и моноцитов [11].

К противовоспалительным цитокинам относятся: IL-1RA (interleukin-1 receptor antagonist, антагонист рецептора интерлейкина 1), блокирующий взаимодействие IL-1β с клеточным рецептором и препятствующий реализации его эффектов; IL-10 (interleukin-10, интерлейкин 10) – ингибитор провоспалительного цитокинового каскада, играющий ведущую роль в противовоспалительной реакции [12]. Ведущее значение в воспалительной иммунной реакции имеет VEGF (vascular endothelial growth factor, васкулоэндотелиальный фактор роста), который является многофункциональным ангиогенным цитокином [13][14].

Следовательно, изучение механизмов и каскадов реакций в тканях пародонта при воспалении считается перспективным с точки зрения разработки новых методов и подходов к лечению гингивитов и пародонтитов [15].

Разрушение тканей, сопровождающее многие хронические аутоиммунные воспалительные заболевания у детей, такие как ювенильный ревматоидный артрит (ЮРА), воспалительные заболевания кишечника, анкилозирующий спондилоартрит, псориаз и астма, также регулируется иммунным ответом хозяина. Общность каскада воспалительных реакций при соматических заболеваниях и при воспалительном процессе в тканях пародонта обусловлена появлением аутоантигенных свойств у клеток и нарушением баланса цитокиновой регуляции иммунологических процессов [16]. При этом воспалительный процесс в тканях пародонта становится хроническим как следствие нарушения баланса провоспалительных и противовоспалительных цитокинов.

В связи с этим одним из перспективных направлений разработки персонализированного плана лечения служит изучение патогенетических механизмов заболеваний тканей пародонта у детей с нарушением системы иммунологического надзора. Цель представленного исследования: изучить цитокиновый профиль ЗДЖ у детей с ЮРА.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проведено пилотное одномоментное одноцентровое исследование по определению содержания прои противовоспалительных цитокинов и хемокинов в ЗДЖ у детей с ЮРА. Исследование одобрено локальным комитетом по этике (протокол № 4 от 15.04.2010).

Клинический этап исследования выполнялся на базе Университетской детской клинической больницы ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет) с 1 марта по 30 апреля 2022 года. Нормативной базой для его выполнения был Федеральный закон от 21 ноября 2011 г. № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2011, № 48, ст. 6724)¹.

Производился сплошной набор пациентов. Всего обследовано 30 детей с ЮРА в возрасте от 6 до 15 лет, проходивших лечение в ревматологическом отделении. У всех пациентов диагноз «Ювенильный ревматоидный артрит» (код по международной классификации болезней 10-го пересмотра: M08.0) был установлен на основе клинико-лабораторных данных.

Критериями невключения в исследование были: наличие острого воспалительного заболевания (2 пациента), текущее ортодонтическое лечение (4 пациента); критерий исключения: решение родителей/ представителей ребенка прекратить участие в исследовании на любом из его этапов (4 пациента). Таким образом, в итоговый анализ включены 20 пациентов с ЮРА, из них на момент исследования низкая активность заболевания отмечена у 5 (25%), средняя активность – у 12 (60%), высокая – у 3 (15%) детей. Большая часть пациентов – 14 (70%) в качестве базисной терапии получала генно-инженерную биологическую терапию (ГИБТ), все пациенты получали нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП).

В контрольную группу были включены 10 пациентов в возрасте от 9 до 16 лет, не имевших ЮРА и проходивших стоматологическое обследование на кафедре детской, профилактической стоматологии и ортодонтии Института стоматологии имени Е.В. Боровского ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет) в сроки набора группы исследования. Критериями невключения были: ортодонтическое лечение, местные или системные острые/ хронические заболевания.

Обязательным условием включения детей в группу исследования и контроля было наличие подписанного информированного согласия родителем или официальным представителем ребенка.

Стоматологическое обследование детей проводили по стандартной схеме, включающей данные анамнеза, объективного внешнего и внутриротового обследования. Индекс интенсивности кариеса определялся суммой постоянных зубов с кариозными полостями, пломбами и числом удаленных зубов (индекс КПУ). При значениях КПУ 0–1,1 уровень интенсивности кариеса определялся как очень низкий, 1,2–2,6 – низкий, 2,7–4,4 – средний, 4,5–6,5 – высокий и 6,6 и выше – очень высокий.

Упрощенный индекс оценки гигиены – OHI-S (Oral Hygien Indices – Simplified) по методу J.C Green, J.K. Vermillion определяли, окрашивая 6 индексных зубов. Уровень гигиены по индексу OHI-S оценивали по следующим критериям: 0–0,6 балла – хороший уровень гигиены, 0,7–1,8 – удовлетворительный, 1,9–2,5 – неудовлетворительный, более 2,6 – плохой.

Десневой индекс GI (gingival index) по Н. Silness и J. Loe, который позволяет определить локализацию и тяжесть течения гингивита, определяли с помощью зондирования десны в области индексных зубов пародонтальным зондом. Степень тяжести гингивита определяли по критериям: 0,1–1,0 балла – легкая, 1,1–2,0 – средняя, 2,1–3,0 – тяжелая степень. Выраженность кровоточивости десны оценивали по индексу кровоточивости десен GBI ( Gingival Bleeding Index) по J. Ainamo и I. Bay. Если кровотечение происходило в течение 10 секунд, регистрировался положительный результат и записывалось количество положительных участков, которое затем выражалось в процентах от количества обследованных участков.

Для забора ЗДЖ использовали общепринятый метод: изначально участок десны очищали от налета и высушивали с помощью стерильных ватных валиков. Получение жидкости из зубодесневой борозды проводили с помощью специальных бумажных абсорбирующих эндодонтических штифтов (Absorbent Paper Points, размер 25, President Dental, Германия), которые удобны для погружения в зубодесневую борозду. Материал данных штифтов представляет собой бумагу, обладающую высокой абсорбирующей способностью и не содержащую примеси. С помощью пинцета штифты погружали в зубодесневую борозду центрального правого резца в течение 1–2 минут для пропитывания ЗДЖ, далее штифт погружали в пробирку типа Eppendorff (Eppendorf Austria GmbH), содержащую 1 мл раствора хлорида натрия с 0,2% биоцида ProClin серии 300. Пробирки встряхивали с помощью центрифуги-вортекс СМ 70М-07 (ELMI, Латвия) в течение 10 минут. В результате получали образцы ЗДЖ с разведением 1:100. Их замораживали при -80 °С и хранили до проведения анализа.

В образцах ЗДЖ с помощью набора реагентов для иммуноферментного анализа ООО «ВекторБест» (Российская Федерация, Новосибирск) определяли концентрацию IL-18, IL-10, IL-1β, IL-1RA, MCP-1, VEGF.

Статистическая обработка данных

Данные представлены как абсолютное число пациентов и процент от общей численности группы. Для определения нормальности распределения непрерывных данных в группах использовали тест Шапиро – Уилка. Для признаков с нормальным распределением переменных данные представлены в виде среднего и стандартного отклонения, при сравнении групп использовался t-критерий Стьюдента. Признаки с ненормальным распределением представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25-й; 75-й процентили), при сравнении таких признаков между группами использовали непараметрический критерий Уилкоксона. В качестве порогового значения принят уровень значимости р < 0,05. Статистическая обработка данных производилась с помощью статистических пакетов: IBM SPSS Statistics 21.0 (IBM Corporation, США) и MedCalc v.16.8.4. (MedCalc Software Ltd, Бельгия).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристики групп по гигиеническому состоянию полости рта

Группа детей с ЮРА была сопоставима по возрасту и полу с контрольной группой.

Были выявлены существенные различия в стоматологическом статусе детей. Так, у детей с ЮРА индекс КПУ был выше, чем аналогичный показатель в контроле. Удовлетворительная или хорошая гигиена полости рта отмечена у 55% пациентов в группе ЮРА и 90% в контроле. Эти данные подтверждены индексной оценкой OHI-S: установлено повышение данного индекса в группе пациентов с ЮРА (табл. 1).

Состояние тканей пародонта, оцениваемое по пародонтальным индексам, выявило, что значение индексов GI и GBI в группе пациентов с ЮРА было статистически значимо выше, чем в группе контроля (табл. 1). Средняя и тяжелая степень гингивита отмечена у 90% детей с ЮРА, в группе контроля только у 20% детей выявлена средняя степень гингивита, у остальных – легкая.

Концентрация цитокинов в зубодесневой жидкости

Анализ содержания провоспалительных цитокинов в ЗДЖ показал более низкое содержание IL-18 – 6,70 (4,97–7,92) пг/мл в группе ЮРА по сравнению с контролем – 11,25 (8,70–13,10) пг/мл (р < 0,05). Концентрация IL-1β была повышена – 15,30 (13,79–17,18) пг/мл в группе пациентов с ЮРА по сравнению с контрольной 5,36 (5,32–5,54) пг/мл (р < 0,05) (рис. 2А, В).

При анализе содержания противовоспалительных цитокинов были получены следующие данные: содержание IL-10 в группе ЮРА 3,60 (2,89–4,45) пг/мл, в контрольной группе – 1,90 (1,54–3,10) пг/мл (различия статистически не значимы). Концентрация другого противовоспалительного цитокина, IL-1RA, была ниже в группе пациентов с ЮРА, чем в контроле: 3638,5 (2397,5–4133,5) и 4951,0 (4303,0–5455,0) пг/мл соответственно (р < 0,05). (рис. 2C, D).

Содержание МСР-1 в ЗДЖ не имело значимых различий в группах: 15,65 (14,15–17,39) и 15,50 (12,80–21,20) пг/мл соответственно. Одновременно с этим концентрация VEGF в группе ЮРА была в несколько раз выше по сравнению с контролем: 49,60 (41,95–54,50) и 12,00 (11,00–13,00) пг/мл соответственно (р < 0,05) (рис. 2E, F).

ОБСУЖДЕНИЕ

В нашем исследовании отмечена тенденция к увеличению тяжести заболеваний пародонта у детей с ЮРА: у 18 (90%) пациентов выявлен гингивит средней или тяжелой степени, отмечено повышение индекса GI и GBI, что согласуется с данными ряда авторов [17][18].

В ЗДЖ пациентов с ЮРА установлен дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов. Так, уровень провоспалительного IL-18 был ниже, в то время как содержание IL-1β выше, чем в контроле. Следует отметить, что концентрация MCP-1 в исследуемой группе не отличалась от контрольной. Одновременно отмечено снижение содержания противовоспалительного IL-1RA в ЗДЖ пациентов с ЮРА, тогда как содержание IL-10 имело тенденцию к повышению по сравнению с контрольной группой. Концентрация VEGF в ЗДЖ была статистически значимо выше у пациентов с ЮРА.

Причины и механизмы прогрессирования гингивита при ЮРА до настоящего времени до конца не установлены. Содержание провоспалительных цитокинов и хемокинов, таких как IL-18 и MCP-1, в ЗДЖ значимо не отличалось от данных контрольной группы, что, возможно, связано с терапией основного заболевания – с применением НПВП и ГИБТ, непосредственно подавляющих продукцию ряда основных провоспалительных цитокинов. Некоторые авторы считают, что НПВП снижают активность иммунных клеток, поэтому при прекращении их фармакологического действия иммунные клетки повторно активируются [19]. M. Hatipoğlu и соавт. [20] установили, что у взрослых пациентов, принимающих анти-B-клеточную терапию, понижается уровень IL-1β в ЗДЖ, что позволяет предположить, что лечение ревматоидного артрита (РА) может изменять биохимические параметры ЗДЖ. Такие же выводы приводятся B. Cetinkaya и соавт. [21] при изучении концентрации в ЗДЖ таких цитокинов, как IL-1β, IL-4, IL-10и TNF-α (tumor necrosis factor-α, фактор некроза опухоли альфа): иммунологическая оценка не выявила статистически значимых различий в уровнях провоспалительных и противовоспалительных цитокинов между пациентами с РА и контролем. При этом в ряде других исследований было обнаружено, что концентрации IL-1β, IL-4, IL-10, матриксной металлопротеиназы-8, -13 и TNF-α в ЗДЖ были выше у пациентов с РА, чем в контроле. Так, B. Acar и соавт. [22] выявили повышенный уровень противоспалительного цитокина IL-10 на фоне ГПБТ пациентов с ЮРА.

Ряд исследователей считает важным определение IL-1β и IL-18 в ЗДЖ, так как их содержание прямо коррелирует с наличием ряда пародонтопатогенных бактерий, таких как F. nucleatum, C. rectus, P. microsи S. intermedius. Так, у детей с ЮРА L.A. Miranda и соавт. [23] были выявлены повышенные уровни IL-1β и IL-18 в сыворотке, что коррелировало с изменением микробиоты в ЗДЖ. Эти же авторы указывают, что начинающаяся потеря прикрепления, наблюдаемая у детей с ЮРА, может быть связана с измененной системной воспалительной реакцией [23]. При этом цитокины, продуцируемые клетками организма хозяина, играют важную роль в патогенезе как РА, так и заболеваний тканей пародонта. Так, в исследовании F.Y. Bozkurt [24] у пациентов с сочетанием этих заболеваний уровень IL-10 был значительно выше, чем в контроле. Наши данные согласуются с этим исследованием: отмечена тенденция к повышению IL-10 в группе детей с ЮРА.

При развитии хронического воспаления в тканях пародонта развивается гипоксия, которая активирует секрецию резидентными и воспалительными макрофагами различных цитокинов, регулирующих процесс ангиогенеза (например, VEGF) [13]. Таким образом, повышенный уровень VEGF в ЗДЖ у детей с ЮРА может быть маркером гипоксии в тканях пародонта.

Наше исследование имело ряд ограничений, связанных с небольшим объемом выборки и разной степенью активности заболевания у пациентов с ЮРА.

Выявление цитокиновых маркеров и предикторов воспаления, в том числе и аутовоспаления, в ЗДЖ у детей с нарушениями системы иммунологического надзора (например, при ЮРА) является перспективным направлением научных исследований, таким, как и исследование влияния цитокинов на культуральные макрофаги ротовой жидкости, изучение взаимосвязи микробиоты полости рта с изменениями уровня цитокинов ЗДЖ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в развитии гингивита у детей с ЮРА играет роль дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов. Установлено повышенное содержание в ЗДЖ IL-1β, который является триггером всех провоспалительных цепочек, снижение IL-1RA – противовоспалительного цитокина, повышение VEGF – маркера гипоксии. Изучение цитокинового профиля ЗДЖ уточняет механизмы развития иммуновоспалительной реакции в тканях пародонта, требует дальнейшего изучения и перспективно в выборе персонализированного подхода к терапии.

ВКЛАД АВТОРОВ

О.Л. Морозова и О.И. Адмакин разработали основную концепцию и дизайн исследования, а также проводили редактуру статьи. Ю.А. Козлитина и Н.Б. Захарова выполняли экспериментальную часть, отбирали и анализировали биоматериал, осуществляли лабораторные исследования. Н.С. Морозова интерпретировала полученные лабораторные данные, а также написала основную часть финальной версии статьи. Все авторы утвердили окончательную версию публикации.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.