Морфологические характеристики коры головного мозга мини-свиньи в условиях генной терапии после экспериментального инсульта

Ишемический инсульт, в переводе с латинского «удар», известный с античных времен как апоплексия, характеризуется фокальным инфарктом головного мозга (ГМ), возникающим в результате окклюзии мозговой артерии [1]. Степень тяжести неврологической дисфункции, развивающейся в результате инсульта, зависит от калибра артерии и области мозга, вовлеченной в патологический процесс [2]. Основные подходы к лечению инсульта заключаются в восстановлении проходимости окклюзированного сосуда, сопутствующей симптоматической терапии и реабилитационных мероприятий [3]. Клетки реактивной нервной ткани вокруг первичного очага необратимых нарушений, так называемая ишемическая полутень, или пенумбра, сохраняют жизнеспособность в течение терапевтического окна длительностью 3–6 часов [4]. Лечения, направленного на стимуляцию нейропластичности мозга и минимизацию объема развивающихся необратимых повреждений после инсульта в ишемической полутени, до сих пор не существует [5]. Поэтому в настоящее время активно разрабатываются методы генной и клеточной терапии, в первую очередь нацеленные на сдерживание негативных последствий инсульта в области пенумбры.

Известно, что общие принципы нейроонтогенеза могут быть применимы и к механизмам нейрорегенерации [6]. Так, нейротрофические факторы, продуцируемые нервными и глиальными клетками в формирующемся мозге, обеспечивают миграцию, выживаемость и терминальную дифференцировку нейрональных клеток-предшественниц, а также направленный рост аксонов, синаптогенез и формирование нейронных сетей [7]. Это указывает на потенциальную возможность использования нейротрофических факторов для стимулирования нейрорегенерации у пациентов с разнообразными заболеваниями центральной нервной системы (ЦНС) [8]. Для ослабления последствий патологических процессов в ЦНС уже используют в эксперименте: нейротрофины – фактор роста нервов (Nerve growth factor, NGF), нейротропный фактор мозга (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF), нейротрофин-3 и нейротрофин-4/5; глиальный нейротрофический фактор (Glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF), ньютурин, артемин и персефин; нейропоэтические цитокины – цилиарный нейротрофический фактор (Ciliary neurotrophic factor, CNTF), фактор, ингибирующий лейкемию (Leukemia inhibitory factor, LIF), интерлейкин 6 (Interleukin-6, IL-6); сосудистые эндотелиальные факторы роста (Vascular endothelial growth factor, VEGF) – VEGF-А, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, фактор роста плаценты (Placental growth factor, PGF); инсулиноподобные факторы роста (Insulin-like growth factor, IGF) – IGF-1, IGF-2 и нейрональные молекулы клеточной адгезии (Neural cell adhesion molecule, NCAM), в том числе белок L1 [8–10]. В многочисленных доклинических исследованиях на лабораторных животных доказана целесообразность использования генной терапии при ишемическом инсульте ГМ [11]. Доставка в область ишемического повреждения рекомбинантной комплементарной ДНК, кодирующей нейротрофические факторы BDNF, VEGF-А, NGF, GDNF, CNTF и основной фактор роста фибробластов (Basic fibroblast growth factor, bFGF), продемонстрировала положительное влияние указанных факторов на постишемическое восстановление мозга [9][11][12].

В настоящее время генотерапевтические препараты, экспрессирующие нейротрофические факторы, преимущественно исследуют в экспериментах с инсультом, применяя их непосредственно, после его возникновения. Однако пока нет однозначного ответа на вопрос о возможности использования превентивной генной терапии ишемического инсульта, в том числе и в клинике, с целью стимулирования физиологических адаптивных механизмов нервной ткани еще до наступления инсульта, например у пациентов, подверженных высокому риску нарушения мозгового кровообращения. Преобладающее число экспериментов, когда терапевтические гены нейропротекторных молекул доставляли в ЦНС в различные временные интервалы до моделирования инсульта, выполнено на грызунах [13].

В наших продолжающихся исследованиях для сдерживания негативных последствий ишемического инсульта головного мозга у мини-свиней была разработана терапия, основанная на доставке в очаг инсульта с помощью аутологичных лейкоцитов из периферической крови генов, кодирующих нейропротекторные факторы [14]. Лейкоконцентрат, обогащенный генами VEGF165, GDNF и NCAM1, вводили внутривенно в острую фазу инсульта (через 4 часа после окклюзии дистальной ветви средней мозговой артерии) или превентивно (за 2 суток до моделирования инсульта) [14]. На эффективность такого аутологичного лейкоконцентрата (АутоЛК) с тремя терапевтическими генами указывало: сдерживание увеличения объема инфаркта, положительное ремоделирование клеток нейроглии и восстановление уровня экспрессии синаптических белков в нейронах периинфарктной области как в условиях превентивной генной терапии, так и генной терапии в острую фазу ишемического инсульта [14].

Цель исследования: изучить влияние АутоЛК с генами VEGF165, GDNF и NCAM1 на морфологическую сохранность нервной ткани в области ишемического повреждения коры ГМ у мини-свиньи, а также миграцию генетически модифицированных лейкоцитов, трансдуцированных химерными аденовирусными векторами 5 серотипа с фибером 35 серотипа (Chimeric Adenovirus serotype 5 with Fiber serotype 35, Ad5/F35), несущих ген зеленого флуоресцентного белка (Green fluorescent protein, GFP).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Настоящий эксперимент проведен на 8-месячных вьетнамских вислобрюхих мини-свиньях (25–30 кг; n = 16) [15]. Для моделирования инсульта были отобраны самки по причине того, что негативные последствия острого ишемического инсульта у женщин более тяжелые, чем у мужчин [16]. Животных содержали по одному в индивидуальном загоне в условиях 12-часового режима ночь/день при температуре 24–25 °C с кондиционированием воздуха и контролируемым доступом к корму и воде.

Способы получения и введения АутоЛК, обогащенного генами нейротрофических факторов, и моделирование инсульта представлены ниже в сокращенном виде, их подробное описание приведено в нашей публикации, упомянутой выше [14].

Морфологические изменения в коре ГМ на фоне генной терапии изучали через 21 сутки после моделирования инсульта с помощью гистологических методов окраски фронтальных парафиновых срезов головного мозга подопытных животных. Конечная точка эксперимента была выбрана на основании продолжительности острого периода инсульта в течение 3 недель, а также 3-недельного периода активности аденовирусного вектора [17]. Для обзорного исследования очага ишемического повреждения использовали окраску гематоксилином и эозином; морфологические изменения в нейронах выявляли путем импрегнации серебром по методу Бильшовского – Грос – Лаврентьева; сохранность (жизнеспособность) нейронов оценивали окраской толуидиновым синим по Нисслю; для изучения плотности васкуляризации и выраженности фиброза применяли трехцветную окраску по Массону с анилиновым синим.

Получение аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генами VEGF165, GDNF и NCAM1

У всех подопытных мини-свиней под анестезией с помощью Zoletil®100 (Virbac Sante Animale, Франция), 3 мг/кг внутримышечно, в асептических условиях из подключичной вены забирали 50 мл крови в контейнеры (гемакон), содержащие 35 мл раствора гемоконсерванта ЦФДА-1 (Green Cross Corporation, Республика Корея). Лейкоконцентрат готовили в гемаконе по нашему оригинальному протоколу, который последовательно включает седиментацию эритроцитов с помощью 6% гидроксиэтилкрахмала с последующим центрифугированием (ускорение 34g) в течение 10 мин при 10 ºC (центрифуга DP-2065 R PLUS, Presvac S.R.L., Аргентина) и промывки физиологическим раствором. После чего надосадочную жидкость с помощью фракционатора компонентов крови ФК-01 (ООО «Лидкор», Россия) экстрагировали, а оставшуюся в контейнере жидкость, содержащую лейкоциты, считали лейкоконцентратом.

Далее полученный лейкоконцентрат трансдуцировали с помощью Ad5/F35, несущих последовательности генов человека: VEGF165 (Ad5/F35-VEGF165), GDNF (Ad5/F35-GDNF) и NCAM1 (Ad5/F35-NCAM1) в равном соотношении каждого вектора. С помощью стерильного шприца смесь трех генетических конструкций вводили в гемакон с лейкоконцентратом.

Соотношение клеток лейкоконцентрата и аденовирусных векторов составляло 1:10 – таким образом, множественность заражения (multiplicity of infection, MOI) равнялась 10. Трансдукцию лейкоконцентрата проводили при температуре 21–22 °С и постоянном покачивании на шейкере. Через 12 ч в контейнер добавляли 200 мл стерильного физиологического раствора и центрифугировали при 1000 оборотах в минуту и температуре 10 °С в течение 10 мин. Далее с помощью фракционатора экстрагировали надосадочную жидкость, включающую в себя физиологический раствор, фрагменты клеток крови и свободные вирусные частицы, таким образом, чтобы в контейнере осталось приблизительно 30 мл физиологического раствора с лейкоконцентратом. До введения экспериментальным животным генетически модифицированный лейкоконцентрат хранили при температуре 21–22 °С при постоянном покачивании на шейкере, время от забора крови и до введения концентрата животным не превышало установленного срока для выделения лейкоконцентрата из пуповинной крови человека с целью криоконсервации.

Для исследования миграции генетически модифицированных лейкоцитов после внутривенной инфузии готовили лейкоконцентрат, трансдуцированный с помощью Ad5/F35-GFP.

Моделирование ишемического инсульта головного мозга у мини-свиней

В эксперименте использован разработанный нами протокол, включающий окклюзию правой общей сонной артерии и левой средней мозговой артерии. Животных наркотизировали с помощью Zoletil®100 и подключали к ингаляционному наркозному аппарату MinorVet Optima (Zoomed, Россия), по которому подавали 2,0–2,5% смесь изофлурана (Laboratorios Karizoo. S.A., Испания) с кислородом. После трепанации левой височной кости под операционным микроскопом YZ-20T9 (Nanjing Redsun Optical Co., Ltd. Китай) рассекали твердую мозговую оболочку, подводили биполярный пинцет под предварительно выделенные и приподнятые над уровнем поверхности мозга сосуды и путем электрокоагуляции прижигали дистальные ветви левой средней мозговой артерии. Для уменьшения кровотока в виллизиевом круге дополнительно перевязывали правую общую сонную артерию. Послеоперационный уход включал в себя терапию: анальгезирующую – кеторолак 30 мг/мл 2 р/д в/м 10 дней (Dr. Reddy`s Laboratories, Ltd., Индия); антибактериальную – цефотаксим 1 г/5 мл 1 р/д в/м 7 дней («ПромоМед Рус» ООО, Россия) и инфузионную – физиологический раствор 400,0 мл подкожно капельно 1 р/д 3 дня [18].

Экспериментальные группы животных

Для изучения влияния генетически модифицированного АутоЛК на морфологическую сохранность нервной ткани в области ишемического повреждения коры ГМ животные были разделены на 4 группы. Мини-свиньям из группы генной терапии инсульта в острой фазе (n = 3) за 14–16 ч до моделирования инсульта готовили АутоЛК, трансдуцированный Ad5/F35-VEGF165, Ad5/F35-GDNF и Ad5/F35-NCAM1 (что соответствовало времени его получения) и вводили через ушную вену через 4 ч после операции. Животным из группы превентивной генной терапии (n = 3) такой же АутоЛК готовили и вводили за 2 суток до моделирования инсульта. Животным контрольной группы (n = 3) вводили 30 мл физиологического раствора. Интактные мини-свиньи (n = 3) служили для сбора базовых показателей исследования.

Для изучения миграции генетически модифицированных лейкоцитов АутоЛК, трансдуцированный Ad5/F35-GFP, вводили за 2 суток (n = 2) или через 4 часа (n = 2) после моделирования инсульта (рис. 1).

Гистологические методы исследования

Через 21 сутки после моделирования инсульта всех животных наркотизировали с помощью Zoletil®100 и выводили из эксперимента путем введения хлористого калия (150 мг/кг) через ушную вену. Головной мозг извлекали из черепной коробки и фиксировали в 4% растворе параформальдегида в течение недели, далее готовили фронтальные срезы толщиной 3 мм через область инфаркта. Для гистологического исследования выбирали срез с максимальным кратерообразным повреждением по типу «минус ткань», вырезали фрагменты по краю кратера размером 2×2 см (рис. 2). Полученные образцы помещали в кассеты, обрабатывали с помощью гистопроцессора АГОТ-1 (АО «Орион Медик», Россия) согласно инструкции завода-изготовителя по стандартному протоколу проводки через спирт-ксилол и готовили парафиновые блоки с использованием заливочной станции HistoDream EW (Milestone Medical, Италия). Образцы головного мозга интактных животных для гистологического исследования получали из области, соответствующей инфаркту у подопытных животных, в тот же день. Фронтальные парафиновые срезы мозга толщиной 5 мкм готовили с помощью ротационного микротома HM 325 (Thermo Fisher Scientific, США), окрашивали гематоксилином и эозином, толуидиновым синим по Нисслю, анилиновым синим по Массону, импрегнировали серебром по методу Бильшовского – Грос – Лаврентьева. Оцифрованные изображения гистологических препаратов получали с помощью микроскопа Zeiss Axio Scope.A1 (Zeiss, Германия). Морфометрический анализ проводили с использованием программы ImageJ (NIH, США).

Морфологический анализ проводили в пограничной с инфарктом области коры ГМ на расстоянии 1 мм и в периинфарктной реактивной области, прилегающей к пограничной на расстоянии 4 мм.

Окраска гематоксилином-эозином

Окрашивание срезов проводили по стандартному протоколу с помощью гематоксилина Эрлиха и спиртового раствора эозина, далее дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли и заключали в среду Витрогель (все препараты для окраски – ООО «БиоВитрум», Россия). Микроскопический анализ включал в себя оценку патологических изменений в пограничной и периинфарктной зонах ишемического повреждения коры ГМ: наличие и выраженность периваскулярного отека, некроза, кровоизлияний, лейкоцитарной инфильтрации.

Окраска толуидиновым синим по Нисслю

В 50 мл раствора толуидинового синего добавляли 2 мл модификатора окраски по Нисслю согласно инструкции изготовителя (ООО «БиоВитрум», Россия). В этот раствор погружали депарафинизированные препараты на 4 мин и дифференцировали в 96% уксуснокислом растворе этанола. Окрашенные препараты просветляли и заключали в среду Витрогель. Жизнеспособность нейронов оценивали по следующим признакам: размер клеток, сохранность плазматической мембраны, сохранность клеточного ядра и ядрышка, состояние тигроидного вещества, наличие патологических включений. Пикнотически измененные нейроны определяли по уменьшению размера клетки (сморщивание), гиперхромии и отсутствию клеточных структур. Подсчет пикнотических нейронов проводили относительно общего количества нервных клеток в пограничной и периинфарктной зонах по 0,3 мм² площади каждой. Данные представлены в виде медианы количества пикнотических нейронов [1 квартиль; 3 квартиль] на 100 нейронов.

Импрегнация серебром по методу Бильшовского – Грос – Лаврентьева^3,4

Депарафинизированные срезы инкубировали в 20% растворе нитрата серебра в течение 60 мин, после чего препараты быстро проводили через 5 ванночек, наполненных 20% формалином на водопроводной воде, и помещали для импрегнации в заранее подготовленный рабочий раствор аммиачного серебра (1 мл 20% раствора нитрата серебра титровали 10% раствором аммиака до исчезновения осадка оксида серебра). Срезы импрегнировали под визуальным контролем с помощью микроскопа в течение 5–10 мин, помещали на 15 мин в аммиачную воду, а затем на несколько часов в дистиллированную воду для промывки. Окрашенные препараты дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли и заключали в среду Витрогель. Морфологическое исследование включало в себя оценку архитектуры коры, а также состояние нейронов и их отростков.

Трехцветная окраска по Массону с анилиновым синим.

Окрашивание препаратов проводили по следующему протоколу: на депарафинизированные срезы наносили 8 капель рабочего раствора железного гематоксилина Вейгерта на 10 мин. После просушивания на срезы наносили по 6 капель спиртового раствора пикриновой кислоты на 4 мин, раствора кислого пунцового фуксина на 4 мин, затем раствора фосфорно-молибденовой кислоты на 10 мин – между реагентами срезы промывали в дистиллированной воде. Далее срезы подсушивали и на 5 мин наносили 6 капель раствора анилинового синего с последующей промывкой в дистиллированной воде, затем дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли и заключали в среду Витрогель. Микроскопический анализ препаратов включал выявление волокнистых структур для оценки выраженности соединительной ткани. Морфометрический анализ плотности васкуляризации проводили в пограничной и периинфарктной зонах ишемического повреждения коры ГМ на площади 1,5 мм² в каждой зоне методом подсчета количества капилляров (сосудов диаметром 5–10 мкм).

Люминесцентная микроскопия

Через неделю после внутривенной инфузии лейкоцитов, экспрессирующих ген GFP, у животных забирали головной мозг, селезенку и поднижнечелюстные лимфатические узлы. Образцы из левого (в области инфаркта) и соответствующей области правого полушарий, селезенки и лимфатических узлов фиксировали в 4% растворе параформальдегида, в целях криопротекции насыщали 30% раствором сахарозы, заливали в среду для замораживания тканей Neg 50 (Thermo Scientific, США) и готовили срезы толщиной 20 мкм на криостате Microm HM 560 (Thermo Scientific, США). Полученные срезы для визуализации клеточных ядер инкубировали в 10 мкг/мл раствора 4’,6-диамидино-2-фенилиндола (4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) в фосфатно-солевом буфере (Sigma, США) и заключали в среду для защиты от выгорания флуоресценции Fluoroshield™ (Sigma Aldrich, США). Оцифрованные изображения получали с помощью люминесцентного микроскопа Zeiss Axioscope A1 (Zeiss, Германия).

Статистический анализ

Описательные статистики представлены в виде медиан и интерквартильного размаха (25-й; 75-й процентили). Для сравнения значений количественных переменных между группами применяли тест Краскела – Уоллиса. Для попарных межгрупповых сравнений использовали тест Данна, различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Статистический анализ полученных данных проводили в среде для статистических вычислений R 4.1.2 (R Foundation for Statistical Computing, Австрия)⁵.

Результаты

Обзорное исследование очага ишемического повреждения

На препаратах мозга у животных контрольной группы очаг ишемического повреждения имеет кратерообразную форму по типу «минус-ткань» (рис. 2).

На срезах ГМ, окрашенных гематоксилином и эозином, в прилегающей к области инфаркта мягкой мозговой оболочке видны реактивные изменения в виде лейкоцитарной инфильтрации, преимущественно мононуклеарной, фиброза и гемосидероза (рис. 3А). В пограничной зоне ишемического повреждения мозга отсутствуют нейроны, встречаются пенистые клетки и участки разрежения с микрокистозными изменениями (рис. 3А). В сосудистом русле выявлены постнекротические явления с оголением сосудистого каркаса, микроциркуляторными расстройствами в виде сладжей, тромбов в капиллярах и экстравазаты. В поверхностных слоях коры обнаруживаются очаги деструкции с небольшой мононуклеарной инфильтрацией, в периинфарктной зоне визуализируются выраженные изменения нейронов в виде: пикноза, гиперхромии, плохо различимых клеточных структур, а также отсутствия отростков (рис. 3А).

На микропрепаратах ГМ мини-свиней из группы генной терапии в острую фазу в пограничной зоне ишемического повреждения отмечаются менее выраженные очаги деструкции, нет существенных изменений микроциркуляторного русла и отсутствует лейкоцитарная инфильтрация. Обнаруживаются нейроны, во многих из которых визуализируются ядра, ядрышки, а также нейриты (рис. 3B). Патологические изменения в периинфарктной зоне не выражены.

В мозге животных из группы с превентивной генной терапией в пограничной с инфарктом зоне определяются единичные пикнотические нейроны и минимальные микрокистозные изменения; нервная ткань периинфарктной зоны демонстрирует большую сохранность при сравнении с мозгом контрольной группы и группы на фоне генной терапии в острую фазу (рис. 3C).

Сохранность нейронов

В пограничной и периинфарктной зонах ишемического повреждения коры больших полушарий у мини-свиней из контрольной группы при окраске по Нисслю визуализируются нейроны с различными признаками дегенерации: вакуолизированной цитоплазмой, сморщенными пикнотическими ядрами, кариолизисом, субстанцией Ниссля либо мелкозернистой, либо не выраженной (рис. 4А), тогда как в обеих группах генной терапии тигроидное вещество сохранено в нейронах и пограничной, и периинфарктной зон (рис. 4B, C). Во всех экспериментальных группах в мозге встречаются нейроны с глиальным сателлитозом, свидетельствующим о повреждении нейронов.

Морфометрический анализ нейронов, подвергшихся пикнозу в периинфарктной зоне ишемического повреждения ГМ экспериментальных мини-свиней, выявил их большее количество в контрольной группе – 49,5 (47,7; 52,9), при сравнении с группами генной терапии: в острую фазу – 31,1 (20,6; 36,36); p = 0,0369, и превентивной – 31,6 (29,5; 36,4); p = 0,0526. В пограничной зоне количество пикнотически измененных нейронов во всех экспериментальных группах не различалось и составило: в контрольной группе 81,0 (69,0; 87,2), в группе с генной терапией в острую фазу 47,0 (44,3; 52,7); р = 0,1011 при сравнении с контрольной группой, и в группе с превентивной генной терапией 64,3 (61,3; 76,1); р = 0,8815 при сравнении с контрольной группой.

Архитектура коры и морфология нейронов

На гистологических препаратах коры теменной области интактных животных, импрегнированных нитратом серебра, визуализируется характерная слоистая архитектура, включающая в себя молекулярный (плексиформный), наружный зернистый, наружный пирамидный, внутренний зернистый, внутренний пирамидный слои и слой полиморфных клеток. Хорошо выражена сетчатая «войлокообразная» структура нервной ткани, обусловленная переплетениями тонких нейритов (рис. 5A).

У всех экспериментальных животных в пограничной зоне ишемического повреждения кора истончена, архитектура нарушена, отсутствует молекулярный слой. В периинфарктной зоне у контрольных животных, в отличие от терапевтических групп, слой наружных зернистых нейронов был истончен. Кроме того, в мозге контрольных животных во втором и третьем слоях наблюдались частичная фрагментация или отсутствие отростков нейронов, фрагментированные нервные отростки имели извитый ход (рис. 5B). В мозге мини-свиней терапевтических групп от нейронов отходили сохранные прямые отростки (рис. 5C, D). Выраженная гиперхромия преимущественно затрагивала нейроны в наружных зернистом и пирамидном слоях во всех трех группах животных с инсультом. Однако нервная ткань у мини-свиней из терапевтических групп имела «войлокообразную» текстуру, соответствующую таковой у интактных животных (рис. 5A, B, C).

Васкуляризация коры в области ишемического повреждения мозга

На гистологических препаратах, окрашенных по Массону (рис. 6А–C), в пограничной и периинфарктной зонах вокруг очага инфаркта у всех экспериментальных животных стенки мелких сосудов утолщены и слоисты. Вокруг сосудов визуализируются периваскулярные соединительнотканные волокна. Морфометрический анализ количества сосудов диаметром 5–10 мкм в периинфарктной зоне выявил значимое увеличение содержания капилляров у мини-свиней в группе с превентивной генной терапией – 14,5 (14,3; 15,1), при сравнении с интактной группой – 10,3 (9,8; 11,1); р = 0,0415, и контрольной группой – 9,0 (8,3; 10,5); р = 0,0127. У животных группы генной терапии в острую фазу количество капилляров в этой зоне составило 12,8 (10,2; 13,4) и не отличалось от аналогичных данных у группы с превентивной генной терапией, р = 0,1129.

Миграция генетически модифицированных лейкоцитов после внутривенной инфузии

Флуоресцентная микроскопия препаратов селезенки и поднижнечелюстных лимфатических узлов экспериментальных животных после внутривенной инфузии АутоЛК, несущего репортерный ген GFP, до и после моделирования инсульта обнаружила лейкоциты со специфическим зеленым свечением. Ранее нами было показано присутствие генетически модифицированных клеток в периинфарктной области в левом полушарии мозга подопытных животных [14], в правом полушарии GFP-позитивные клетки не обнаружены. Результаты микроскопии демонстрируют, что после внутривенной инфузии лейкоциты с Ad5/35-GFP выселяются из кровотока в область ишемического повреждения коры ГМ и органы иммунной защиты и синтезируют рекомбинантный белок GFP.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее при изучении мозга мини-свиней было показано положительное влияние генной терапии на ремоделирование нейроглии и экспрессию синаптических белков в нейронах периинфарктной области мозга путем введения АутоЛК, обогащенного генами VEGF165, GDNF, NCAM1, как в острую фазу инсульта, так и превентивно [14].

В данном исследовании также был смоделирован ишемический инсульт у мини-свиней – на 21-й день при иммунофлуоресцентном исследовании периинфарктной области выявлен апоптоз клеток; увеличение доли микроглии и астроцитов, ответственных за формирование глиального рубца; уменьшение доли миелинообразующих олигодендроглиальных клеток; снижение экспрессии синаптических белков в нервных клетках. При этом в условиях генной терапии АутоЛК, обогащенным генами VEGF165, GDNF, NCAM1, в острую фазу через 4 часа после инсульта и превентивно за 2 суток до инсульта в коре ГМ животных в обеих терапевтических группах были продемонстрированы: (1) уменьшение объема инфаркта и уменьшение доли апоптотических клеток; (2) сдерживание формирования глиального рубца; (3) увеличение количества миелинообразующих клеток. Ранее нами было косвенно подтверждено восстановление функциональной активности нейронов на основании уровня экспрессии белка синаптических пузырьков синаптофизина и белка постсинаптической плотности (PSD95) [14].

В представленном исследовании получены дополнительные доказательства положительного влияния рекомбинантных молекул VEGF165, GDNF и NCAM1 на восстановление нервной ткани в области ишемического повреждения мозга. В мозге животных обеих терапевтических групп в периинфарктной зоне, соответствующей ишемической полутени, выявлено меньше деструктивных изменений и большее количество жизнеспособных нейронов с сохранными нейритами, а также более высокая плотность капилляров, чем в группе инсульта без лечения.

Данные о способности генетически модифицированных лейкоцитов, обогащенных генами VEGF165, GDNF, NCAM1, мигрировать из кровотока через нарушенный гематоэнцефалический барьер в область ишемического повреждения мозга и положительно влиять на ремоделирование нервной ткани дают основание полагать, что они локально продуцируют молекулы VEGF165, GDNF и NCAM1, которые по паракринному механизму сдерживают развитие последствий инсульта в области ишемической полутени. Положительное влияние VEGF165, GDNF и NCAM1 основано на их нейропротекторном действии [19–21], ангиогенных эффектах [19] и свойстве обеспечить миграцию генетически модифицированных лейкоцитов в область инфаркта мозга и выживание в ней [22].

Внутривенная инфузия АутоЛК, обогащенного рекомбинантными генами VEGF165, GDNF и NCAM1, оказывает положительное действие на постишемическую регенерацию мозга мини-свиней в области пенумбры. При этом продукция рекомбинантных молекул VEGF165, GDNF и NCAM1 генетически модифицированными лейкоцитами после их внутривенного введения продолжается не менее 3 недель [17], что соответствует острому периоду инсульта.

Ограничения исследования

При разработке принципов генной терапии для сдерживания дегенеративных процессов и стимулирования регенерации в ЦНС при травмах, ишемических инсультах и нейродегенеративных заболеваниях используются гены, кодирующие различные цитокины и их комбинации, с доказанной в эксперименте эффективностью [23]. При этом в практическую медицину пока не введен ни один одобренный для лечения заболеваний ЦНС генотерапевтический препарат [24]. Ограничения связаны как с подбором терапевтических генов, так и с вектором доставки для конкретной нозологии – согласно характеру заболевания, воздействию на этиологические, патогенетические или симптоматические аспекты, ожидаемому результату.

Результаты настоящего исследования следует считать пилотными из-за ограниченного количества животных и данных, полученных только на самках мини-свиней. Кроме того, представленные выводы основаны на однократном введении генетически модифицированного АутоЛК с комбинацией генов VEGF165, GDNF и NCAM1 в составе химерного аденовирусного вектора Ad5/35 в единственной дозе. Функциональное восстановление животных после экспериментального инсульта на фоне генной терапии позволит комплексно оценить данные поведенческих тестов наряду с морфологическими изменениями в головном мозге.

Тот факт, что генетически модифицированные лейкоциты мини-свиней способны мигрировать в область ишемического повреждения мозга, заселять органы иммунной системы и продуцировать рекомбинантные VEGF, GDNF и NCAM in vitro [25], предполагает необходимость исследовать секрецию и распространение этих терапевтических молекул in situ для установления механизма их действия.

Направления для дальнейших исследований

Вопросы оптимизации трансдукции лейкоконцентрата с помощью комбинации химерных аденовирусных векторов Ad5/35-VEGF165, Аd5/35-GDNF и Ad5/35-NCAM1, объема и кратности введения животным, фармакокинетики, возможных побочных эффектов требуют дополнительных исследований для инициирования комплексных доклинических испытаний. Кроме того, в практической медицине для превентивной генной терапии ишемического инсульта сроки приготовления АутоЛК, обогащенного терапевтическими генами, не так критичны, как для его использования в острую фазу. В этой связи необходимы дальнейшие исследования по решению задачи получения персонифицированного генно-клеточного препарата в пределах времени терапевтического окна.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты настоящего исследования согласуются с полученными ранее данными о положительном влиянии АутоЛК, обогащенного рекомбинантными генами VEGF165, GDNF и NCAM1, на регенерацию нервной ткани в области ишемической полутени мозга у мини-свиней. Через 21 сутки после моделирования инсульта у животных на фоне превентивной генной терапии или генной терапии в острую фазу инсульта установлена лучшая сохранность нейронов и большая плотность кровеносных капилляров в периинфарктной зоне ишемического повреждения мозга. Сведения о миграции генетически модифицированных лейкоцитов и их способности продуцировать рекомбинантный белок дают основание полагать, что терапевтические молекулы VEGF165, GDNF и NCAM1 по паракринному механизму оказывают положительное влияние на жизнеспособность и морфологию нервных клеток, а также на рост кровеносных сосудов.