Модель смерти мозга с постепенной индукцией как основа для экспериментальных исследований донорских органов

Трансплантация органов остается «золотым стандартом» лечения пациентов с терминальной стадией недостаточности сердца, легких, печени и почек [1]. В подавляющем большинстве случаев источником для эксплантации органов являются доноры со смертью мозга вследствие необратимого ишемического, геморрагического или травматического повреждения центральной нервной системы (ЦНС). Смерть мозга вызывает в организме потенциального донора каскад различных гемодинамических, эндокринных и воспалительных реакций, которые оказывают повреждающее действие различной степени выраженности на морфофункциональное состояние трансплантатов [2].

Известен ряд экспериментальных моделей для исследования влияния смерти мозга на состояние донорских органов [3, 4]. В большинстве этих моделей смерть мозга развивается вследствие повышения внутричерепного давления (ВЧД) при раздувании баллона, помещенного в полость черепа. Принципиально данную модель смерти мозга вследствие повышения ВЧД можно разделить на две категории: с быстрой (sudden onset model) или постепенной (gradual onset model) индукцией. В случае быстрой индукции ВЧД повышают в течение 30–60 сек, что сопровождается высокой летальностью экспериментальных животных из-за выраженной сердечно-сосудистой и дыхательной недостаточности. При постепенной индукции ВЧД повышают медленно в течение 5–20 мин, в результате достигается относительная стабилизация системной гемодинамики без потребности во введении инотропных препаратов в течение нескольких часов.

Наиболее известен способ моделирования смерти мозга у мелких лабораторных животных путем трепанации черепа, введения в субдуральное пространство и последующего раздувания баллонного катетера Фогарти 14G, что вызывает необратимое механическое повреждение головного мозга [5]. К недостаткам этого способа моделирования смерти мозга можно отнести необходимость проведения оперативного вмешательства в виде трепанации черепа с помощью специальных хирургических инструментов (микрохирургическая дрель, сверло, баллонный катетер), а также возможные технические сложности, связанные с проведением баллонного катетера в полость черепа через отверстие в кости размером 1×1 мм, что значительно снижает воспроизводимость модели и удорожает ее исполнение.

Цель исследования: апробировать в эксперименте патогенетически адекватную модель смерти мозга вследствие повышения ВЧД с постепенной индукцией, позволяющую оценивать изменения, развивающиеся в органах потенциального донора.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве биомодели были выбраны 6–8-месячные половозрелые беспородные крысы-самцы массой 250–300 г (n = 32). Эксперименты были проведены на кафедрах топографической анатомии и оперативной хирургии и патофизиологии ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет» Минздрава России с соблюдением требований Европейской конвенции по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, а также выводу их из эксперимента и последующей утилизации (Страсбург, 1986) и соответствовало требованиям международных рекомендаций ARRIVE [6]. Минимальное достаточное количество экспериментальных животных в группе, необходимое для получения достоверных результатов, было рассчитано по формуле F. Lopez-Jimenez и соавт. [7] и составило 8 особей.

Эксперимент проводили по разработанному нами способу [8]. С учетом апробации модели острого эксперимента и прогнозируемой высокой летальности в экспериментальную группу вошли 24 животных. Всех крыс экспериментальной и контрольной (n = 8) групп наркотизировали 10% диэтиловым эфиром (ООО ПХФК «Медхимпром», Россия), катетеризировали левую общую сонную артерию для регистрации систолического и диастолического артериального давления, частоты сердечных сокращений (ЧСС), рассчитывали среднее артериальное давление (АДср.) по формуле АДср. = АД диастолическое + 1/3 (АД систолическое – АД диастолическое). Далее осуществляли им интубацию трахеи и переводили животных на искусственную вентиляцию легких (ИВЛ). Схема эксперимента представлена на рис. 1.

Для моделирования смерти мозга (точка 0) в положении животного лежа на животе пальпировали наружный затылочный выступ (protuberantia occipitalis externa) и остистый отросток II шейного позвонка, производили вкол иглы 22G с мандреном в мягкие ткани и далее вдоль чешуи затылочной кости, пунктировали большую цистерну (cisterna magna), что определялось по появлению капли спинномозговой жидкости в канюле после удаления мандрена (рис. 1). Иглу направляли горизонтально, продвигали на всю длину в полость черепа, соединяли с механическим тонометром. В полость черепа нагнетали атмосферный воздух до достижения давления, равного АДср., со скоростью 20 мм рт. ст./мин, время экспозиции повышенного давления составляло 5 мин, после чего ВЧД снижали в 2 раза и прекращали подачу диэтилового эфира в дыхательный контур [8].

Через 30 мин (точка 1) проводили констатацию смерти мозга у экспериментального животного на основании следующих общепринятых критериев [9]: отсутствие самостоятельного дыхания (апноэ), подтвержденное положительным тестом апноэтической оксигенации; полное и устойчивое отсутствие сознания (кома); отсутствие фотореакции зрачков и роговичных рефлексов (рис. 1). В соответствии с протоколом констатации смерти мозга при наличии положительного теста апноэтической оксигенации и признаков смерти мозга при физикальном исследовании дополнительные инструментальные методы (церебральная ангиография, электроэнцефалография, транскраниальная допплерография) не проводятся [9].

Для кондиционирования донора в течение 3 ч животным экспериментальной группы проводили ИВЛ, мониторинг показателей гемодинамики и сердечного ритма, поддерживали температуру тела на уровне 37 °С. При снижении АДср. ниже 75 мм рт. ст. проводили инфузию раствора «Гелофузина» (B.Braun Medical AG, Швейцария) для обеспечения адекватной перфузии потенциальных донорских органов. В этой группе вывод животных из эксперимента заканчивали через 3 ч после моделирования смерти мозга (точка 2) прекращением волемической поддержки и ИВЛ (рис. 1).

На этапе разработки модели смерти мозга 6 животных экспериментальной группы были исключены из исследования по причине развития биологической смерти: 3 крысы из-за проблем с интубацией и проведением ИВЛ и 3 – из-за остановки сердечной деятельности. Погибшим животным выполняли краниотомию с целью валидации экспериментальной модели, при макроскопической оценке степени повреждения головного мозга выявляли множественные кровоизлияния и каудальное смещение мозговых структур с компрессией и вклинением ствола мозга.

Вывод контрольных животных из эксперимента заканчивали через 3 ч (точка 2) удалением катетера из сонной артерии, прекращением подачи анестетика, остановкой ИВЛ и помещением в газовую камеру.

Статистический анализ

Для проверки нормальности распределения полученных данных использовали критерий Шапиро – Уилка. В связи с тем что гипотеза о нормальном распределении данных была отклонена, далее использовали непараметрические критерии. Для оценки различий между показателями гемодинамики контрольной и экспериментальной групп использовали критерий Манна – Уитни. Для оценки различий между показателями гемодинамики до и после моделирования смерти мозга использовали критерий Вилкоксона. Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25-й; 75-й процентили). Критический уровень значимости при тестировании статистических гипотез принимали равным 0,05. Данные обрабатывались с помощью программы Statistica 13.0 (TIBCO, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Смерть мозга была констатирована у всех 18 экспериментальных животных. При оценке их неврологического статуса, по мере повышения ВЧД наблюдался тремор нижних конечностей с преобладанием тонуса мышц-разгибателей, то есть развивалась децеребрационная ригидность. Спустя 30 мин от начала индукции смерти мозга при временном прекращении ИВЛ в течение 1 мин отсутствовали самостоятельные дыхательные движения грудной клетки, а также сознание и мышечный тонус, не вызывались роговичные рефлексы, отсутствовала фотореакция зрачков.

В течение 2 ч эксперимента вследствие прогрессирования недостаточности кровообращения биологическая смерть развилась у 3 крыс (летальность 17%), в течение 3 ч. еще у 7 (летальность 39%). Общая летальность за 3 часа составила 56%.

Динамика показателей АДср. и ЧСС в ходе эксперимента представлена на рисунках 2 и 3.

Показатели АДср. и ЧСС между контрольной и экспериментальной группами до индукции смерти мозга статистически значимо не отличались и составляли АДср. 101 (90; 105) мм рт. ст., ЧСС 310 (297; 315) уд./мин. Через 5 мин от начала индукции смерти мозга в экспериментальной группе было выявлено значительное повышение АДср. до 147 (140; 150) мм рт. ст. (p = 0,01) и ЧСС до 396 (384; 406) уд./мин (р = 0,03). Далее в течение 20 мин отмечалось постепенное снижение АДср. до 94 (90; 100) мм рт. ст. и ЧСС до 290 уд./мин.

В период наблюдения от 26 до 90 мин в экспериментальной группе регистрировалась относительная стабилизация АДср. на уровне 87–92 мм рт. ст., отмечалась тенденция к брадикардии с ЧСС от 263 до 274 уд/мин (p = 0,01) по сравнению с исходными значениями. Через 120 и 150 мин от начала индукции смерти мозга наблюдалось некоторое снижение АДср. до 75–80 мм рт. ст. (p = 0,03), снижение ЧСС до 256–264 уд./мин (p = 0,01) по сравнению с исходными значениями. К концу третьего часа эксперимента, несмотря на волемическую поддержку, у экспериментальных животных продолжалось снижение АДср. до 64 (61; 67) мм рт. ст. (р = 0,02), наряду с этим усугублялась брадикардия до 250 (248; 260) уд/мин (р = 0,01) по сравнению с исходными величинами, что свидетельствует о развитии декомпенсации гемодинамических расстройств.

ОБСУЖДЕНИЕ

В проведенном нами исследовании представлены результаты экспериментальной апробации модели донора со смертью мозга с постепенной индукцией ВЧД. При осуществлении предлагаемого способа индукции смерть мозга является неизбежным следствием постепенного снижения церебральной перфузии, что последовательно приводит сначала к дисциркуляции, а затем и дислокации мозговых структур и, тем самым, к прекращению всех функций головного мозга.

Показано, что в ходе моделирования смерти мозга предлагаемым способом развиваются фазные нарушения центральной гемодинамики, которые характеризуются начальной кратковременной гипердинамической реакцией, сопровождающейся артериальной гипертензией и тахикардией, и последующей продолжительной гиподинамической стадией с развитием артериальной гипотензии и брадикардии, что согласуется с данными литературы [10][11].

Необратимое тотальное повреждение ЦНС с последующим развитием смерти мозга представляет собой мощное стрессорное воздействие на организм в целом. В результате в организме потенциального донора органов запускается выраженная нейроэндокринная реакция, связанная с первоначальной активацией, а затем угнетением гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и симпатоадреналовой систем [12–14]. У пострадавших и у экспериментальных животных со смертью мозга наблюдается значительное повышение концентрации катехоламинов в крови [14][15]. Гиперкатехоламинемия, как известно, ассоциирована со смещением метаболических реакций в сторону преобладания катаболизма, вазоконстрикцией и активацией свободнорадикального окисления, что в конечном итоге приводит к разобщению окислительного фосфорилирования и тканевой гипоксии [15][16].

Смерть мозга как терминальное состояние организма донора является начальным, но далеко не единственным звеном в цепи ишемического повреждения донорских органов в ходе трансплантации. Кроме собственно ишемии, важнейшим звеном в генезе ухудшения морфофунционального состояния трансплантатов выступает системная воспалительная реакция, которая реализуется путем значительного повышения концентрации провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин 1 альфа, интерлейкин 6, фактор некроза опухоли-альфа в крови и активации опосредованных ими проапоптотических сигнальных каскадов в периферических тканях [17][18].

Становится очевидным, что донорские органы, эксплантированные после смерти мозга даже у молодого условно здорового субъекта, не являются в полной мере интактными, а находятся в состоянии исходной, зачастую латентной дисфункции различной степени. Это положение подтверждается данными о худшей выживаемости трупных трансплантатов, в частности почки, в сравнении с органами, полученными от живых родственных доноров [10]. С другой стороны, возможности для коррекции функционального состояния донорских органов после смерти мозга представляют значительный интерес и требуют дальнейших исследований.

Необходимо отметить, что общепринятой экспериментальной модели смерти мозга, в полной мере пригодной для всесторонней оценки развивающихся патологических изменений в донорских органах, в настоящее время не разработано. Так, к существенным недостаткам, присущим моделям смерти мозга с быстрой индукцией, следует отнести необходимость дополнительного введения препаратов инотропного действия для поддержания уровня АДср., что усугубляет вазоконстрикцию и способствует дальнейшему ухудшению кровотока в периферических органах и тканях вплоть до развития ишемического повреждения.

Формирование наблюдаемого паттерна гемодинамических реакций в ответ на значительное повышение ВЧД, по всей видимости, может быть объяснено с позиций утраты поврежденным головным мозгом интегративной функции, а также нарушением вегетативной регуляции сосудистого тонуса и ритма сердца вследствие повреждения сосудодвигательного центра продолговатого мозга. Согласно классическому описанию о компенсаторных реакциях в ответ на увеличение ВЧД, у экспериментальных животных наблюдается артериальная гипертензия, брадикардия и нерегулярное дыхание, что впоследствии было названо рефлексом (триадой) Кушинга [19].

Гипердинамические реакции системы кровообращения при повышении ВЧД, как считается, направлены на обеспечение церебральной перфузии на адекватном уровне. При распространении ишемии на продолговатый мозг происходит резкая активация симпатоадреналовой системы с увеличением сердечного выброса, тахикардией и ростом периферического сосудистого сопротивления. Смерть мозга наступает в случае прогрессирования внутричерепной гипертензии за счет декомпенсации адаптивных реакций стволовых структур и других систем организма. Далее ишемическое повреждение, достигнув шейных сегментов спинного мозга, вызывает симпатическую денервацию сердца и сосудистого русла. Закономерно наступает гиподинамическая стадия расстройств гемодинамики с развитием системной гипотензии за счет брадикардии и утраты вазомоторного тонуса. Критическое состояние гемодинамики усугубляется гиповолемией, которая возникает как последствие повреждения и последующего отека мозга, а также является результатом метаболических, эндокринных и электролитных нарушений [20]. Изменения гемодинамических нарушений, наблюдаемых в эксперименте, являются схожими с таковыми при массивных внутричерепных кровоизлияниях и у доноров со смертью мозга в клинической практике, что может свидетельствовать о патогенетической адекватности предлагаемой биомодели [20].

Проведенное нами экспериментальное исследование носило пилотный характер и было выполнено на выборке ограниченного объема. Следующим этапом исследования будет углубленное изуче- ние выраженности функционально-метаболических и структурных нарушений в органах в ходе кондиционирования донора со смертью мозга и возможности коррекции этих нарушений на предтрансплантационном этапе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты экспериментальной апробации модели потенциального донора с постепенной индукцией смерти мозга, разработанной на беспородных крысах, показали, что она является воспроизводимой, патогенетически адекватной и позволяет оценивать состояние потенциальных донорских органов в течение 3 ч после индукции смерти мозга.