Morphological changes of the digestive canal organs in animals with a model of Alzheimer's disease

РЕЦЕНЗЕНТ А / REVIEWER A

ПЕРВЫЙ РАУНД РЕЦЕНЗИРОВАНИЯ / FIRST ROUND OF PEER-REVIEW

В представленной работе авторы исследуют изменения в органах желудочно-кишечного тракта у трансгенных мышей линии APPswe/PS1dE9, широко используемой в качестве модели болезни Альцгеймера. Работа посвящена актуальной проблеме изучения внецеребральных проявлений нейродегенеративного процесса и роли энтеральной нервной системы в патогенезе болезни Альцгеймера.

К достоинствам исследования следует отнести комплексный подход, включающий поведенческое тестирование животных, морфологические методы исследования, иммуногистохимический анализ нейрональных, глиальных и иммунных клеток. Авторами показано накопление β-амилоида в нейронах энтеральных сплетений желудка, тонкой и толстой кишки, выявлены признаки активации энтеральной глии и макрофагов, а также изменения экспрессии синаптофизина. Полученные результаты подтверждают вовлечение структур энтеральной нервной системы в патологический процесс при болезни Альцгеймера и согласуются с современными представлениями о существовании оси «кишечник–мозг».

Вместе с тем работа имеет ряд недостатков.

Прежде всего следует отметить небольшой объем выборки (по 5 животных в каждой группе), что ограничивает статистическую мощность исследования. Желательно привести обоснование размера выборки либо указать данное обстоятельство в качестве ограничения исследования.

Название статьи и формулировки выводов содержат указание на «морфофункциональные» изменения, однако представленные данные в основном характеризуют морфологическое состояние тканей. Прямые показатели функционального состояния желудочно-кишечного тракта (моторика, транзит кишечного содержимого, секреторная активность и др.) в работе не исследовались. В связи с этим рекомендуется скорректировать интерпретацию результатов либо дополнительно обосновать использование термина «морфофункциональные изменения».

Некоторые выводы носят несколько категоричный характер. В частности, утверждение о накоплении β-амилоида вследствие собственной экспрессии нейронами кишечных сплетений не полностью подтверждается представленными данными, поскольку иммуногистохимическое выявление Aβ не позволяет однозначно судить об источнике его образования. Аналогично увеличение иммунореактивности синаптофизина не обязательно свидетельствует об усилении синаптогенеза и может отражать другие процессы, связанные с нарушением внутриклеточного транспорта и нейрональным стрессом.

В обсуждении желательно более подробно сопоставить полученные результаты с ранее опубликованными работами, в которых уже были описаны амилоидные изменения и нейровоспалительные процессы в энтеральной нервной системе у мышей линии APP/PS1. Это позволит более четко обозначить научную новизну настоящего исследования.

Несмотря на отмеченные замечания, работа представляет интерес для специалистов в области нейробиологии, нейродегенеративных заболеваний и гастроэнтерологии. Полученные результаты расширяют представления о периферических проявлениях болезни Альцгеймера и роли энтеральной нервной системы в развитии патологического процесса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: необходима доработка

ВТОРОЙ РАУНД РЕЦЕНЗИРОВАНИЯ / SECOND ROUND OF PEER-REVIEW

Авторы учли все замечания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: принять к публикации

РЕЦЕНЗЕНТ B / REVIEWER B

ПЕРВЫЙ РАУНД РЕЦЕНЗИРОВАНИЯ / FIRST ROUND OF PEER-REVIEW

В рукописи «Морфофункциональные изменения органов пищеварительного канала у животных с моделью болезни Альцгеймера» представлены результаты исследования морфологических и функциональных изменений в желудке и кишечнике трансгенных мышей линии APPswe/PS1dE9, используемых в качестве модели болезни Альцгеймера. При исследовании в головном мозге в экспериментальной группе были обнаружены амилоидные отложения. В сравнении с контрольной группой у животных линии APPswe/PS1dE9 во всех изученных органах желудочно–кишечного тракта (ЖКТ) было обнаружено депонирование Aβ в нейронах интрамуральных ганглиев также наблюдалось усиление реакции с антителами против синаптофизина в нейронах, активация GFAP+-глии и макрофагов. В межмышечном сплетении толстой кишки увеличилось количество S100В+-клеток. Таким образом было показано, что у животных  линии APPswe/PS1dE9 морфофункциональное состояние структурных компонентов энтеральной нервной системы во многом подобны таковым в органах ЦНС.

Авторы провели тщательное исследование по весьма актуальной теме, экспериментальная парадигма не вызывает сомнений, выводы адекватны результатам. У меня нет возражений по сути, но хотелось бы прояснить некоторые детали.

СТРОКА 179: …подвергали эвтаназии путём наркотизации

Какое вещество, и как именно использовалось для эвтаназии? Есть ли ссылка на с источник?

СТРОКА 180: .. жидкостью Корнуа

Каков состав этой жидкости, чем обусловлен ее выбор? Есть ли ссылка на источник?

Слуховая кора мышей функционально неоднородна, и в моделях болезни Альцгеймера   на мышах слуховая кора демонстрирует зональную уязвимость. Различные зоны обрабатывают разные аспекты звука, патология болезни Альцгеймера приводит к деградации зон обработки высоких частот, кодирования пауз и временной обработки раньше, чем зон обработки низких частот. Если у авторов есть данные, или предварительные соображения относительно проявлений зональной уязвимости слуховой коры при развитии болезни Альцгеймера, было бы очень важно поместить их в рукопись. Если таких данных нет, я посоветовал бы просто уточнить, какие именно зоны слуховой коры исследовались. 

Рукопись хорошо структурирована, иллюстрации соответствуют тексту, цитируемые источники адекватны. Я буду рад рекомендовать рукопись к публикации после незначительных уточнений, перечисленных выше.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: необходима доработка.

ВТОРОЙ РАУНД РЕЦЕНЗИРОВАНИЯ / SECOND ROUND OF PEER-REVIEW

Авторы учли все замечания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: принять к публикации

РЕКОМЕНДАЦИИ НАУЧНЫХ РЕДАКТОРОВ ЖУРНАЛА / RECOMMENDATIONS OF THE SCIENTIFIC EDITORS OF THE JOURNAL

ПЕРВЫЙ РАУНД РЕЦЕНЗИРОВАНИЯ / FIRST ROUND OF PEER-REVIEW

Ключевые замечания:

1. Просим уточнить выбор метода статистического сравнения. Дисперсионный анализ (ANOVA) применяется при сравнении трёх и более групп, тогда как в работе сравниваются две группы. В этом случае корректнее использовать t-критерий (при нормальном распределении признаков) или U-критерий Манна–Уитни (при ненормальном). Тест Тьюки является post-hoc процедурой для попарных сравнений после дисперсионного анализа и для двух групп неприменим. Если в действительности выполнялся более сложный анализ (например, многофакторный ANOVA с учётом отделов ЖКТ), в тексте это явно не отражено. Просим либо подробно раскрыть схему сравнения, либо применить корректные для двух групп критерии. Это повысит достоверность статистических выводов и облегчит их проверку при рецензировании.
2. Просим пересмотреть обоснование выбора параметрических методов. При объёме выборки n = 5 тест Шапиро Уилка не обладает достаточной мощностью, чтобы служить основанием для такого выбора; кроме того, в тексте не приведены результаты проверки нормальности распределения и равенства дисперсий в группах. В этих условиях целесообразнее опираться на методы непараметрической статистики. Это сделает анализ более устойчивым при малой выборке и повысит надёжность выводов.
3. Сравнения проводятся одновременно по нескольким маркерам, отделам ЖКТ и слоям стенки, однако поправка на множественность сравнений не упомянута; при малой выборке это повышает риск ложноположительных результатов. Просим применить коррекцию на множественность и привести точные p-значения либо обосновать отказ от неё. Это снизит вероятность случайных находок и укрепит доказательность результатов.
4. Работа представляет собой экспериментальное исследование in vivo. Необходиомо привести рукопись в соответствие со стандартом ARRIVE для воспроизводимости исследования и оценки риска систематической ошибки. Просим дополнить рукопись и сопроводительные материалы:

• добавить схему эксперимента (дизайн исследования, группы, ключевые временные точки);
• указать пол животных и их происхождение (линия/питомник, поставщик);
• описать критерии включения и исключения животных и образцов из анализа;
• указать, проводились ли рандомизация при распределении животных и ослепление исследователей при количественной оценке иммуногистохимических препаратов (если да - каким образом, если нет - отметить это);
• привести метод анестезии и эвтаназии с указанием препарата (по международному непатентованному наименованию), дозы и пути введения (в тексте указано лишь «путём наркотизации»).

5. В разделе «Реакция GFAP+-глии» имеется внутреннее противоречие: в начале фрагмента описано увеличение реактивности глии (рост числа и степени разветвлённости отростков по данным скелетизации), а в завершающем предложении говорится о её селективном снижении. Просим уточнить характер изменений глии и устранить противоречие либо подробнее раскрыть, в чём оно состоит. Это особенно важно, поскольку речь идёт об одном из ключевых выводов работы.
6. Разделы «Обсуждение» и «Результаты» не вполне согласованы: активация макрофагов (AIF1/Iba1) описана в обсуждении, однако в разделе «Результаты» отсутствуют и соответствующий подраздел, и иллюстрация с количественной оценкой этих клеток. Просим либо дополнить «Результаты» соответствующими данными (репрезентативные изображения и количественная оценка AIF1+-клеток по отделам ЖКТ), либо исключить упоминание активации макрофагов из обсуждения. Это обеспечит возможность проверки обсуждаемых находок при рецензировании.

Незначительные замечания:

1. Необходимо вычитать текст и устранить опечатки. В частности, присутствует грамматическое рассогласование в предложении: «морфофункциональное состояние … подобны» и ряде других мест.
2. Просьба унифицировать написание «жидкость Карнуа» (в тексте встречаются три варианта).
3. Просьба дополнить сведения о производителях антител, микроскопа и микротома указанием города и страны (требования журнала)

ВТОРОЙ РАУНД РЕЦЕНЗИРОВАНИЯ / SECOND ROUND OF PEER-REVIEW

По итогам повторного рассмотрения рукописи просим учесть следующие замечания:

1. Уточнить статистический анализ сравнений между отделами желудочно-кишечного тракта и поправку на множественность. В исправленной версии по сравнению с предыдущей появилось указание на сравнение трех отделов между собой (по бета-амилоиду: количество позитивных нейронов в толстой кишке значимо больше, чем в желудке и тонкой кишке, строки 420–425), что ранее в тексте отсутствовало. В предыдущей версии замечаний было указано, что нужно либо обосновать применение ANOVA, либо отказаться от него в пользу теста Стьюдента при сравнении двух групп. В настоящей редакции рукописи появилось однозначное описание того, что сравнение между тремя группами проводилось, а ANOVA при этом была исключена из методов, хотя факт сравнения между тремя отделами кишечника обосновывает применение ANOVA. Просим также обратить внимание на следующую деталь для исключения недопонимания. В предыдущей редакции рукописи ANOVA был назван единственным статистическим критерием. При этом в статье проводятся как сравнения между двумя группами (например, в разделе про поведенческие), так и сравнения между тремя группами (как теперь явно обозначено в разделе про aβ). В первом случае оправдано применение теста Стьюдента (его авторы корректно добавили), во втором – ANOVA (ее убрали, хотя изменения в тексте прямо обосновывают рациональность ее применения)
2. Пояснить содержание раздела, касающегося обоснования размера выборки. В настоящее время он звучит следующим образом: «Размер выборки рассчитывался по пилотному эксперименту как наименьшее количество животных, получивших статистическую значимость в морфометрических значениях с мощностью более 0,8». Не совсем понятна формулировка «количество животных, получивших статистическую значимость». Также не совсем понятно, как расчет минимально допустимого размера выборки определил значение в 0,66 животных. По возможности просим поделиться расчетными данными, которые базировались на пилотном эксперименте (как-то указано в разделе «материалы и методы»), чтобы можно было воспроизвести расчеты и убедиться в их точности.
3. Уточнить причину противоречия в описании S100B. В разделе «Результаты» и в аннотации указано снижение числа S100B-положительных клеток в межмышечном сплетении толстой кишки, тогда как в «Обсуждении» говорится об увеличении иммунореактивности S100B и «избыточном высвобождении» в межмышечном сплетении. Просим привести направление изменения к единообразию по всему тексту.
4. Уточнить содержание раздела «материалы и методы». В настоящее время в подписях к рисункам фигурирует 3,3′-диаминобензидин, в «методах» он не указан. Просим добавить данный метод в раздел, либо пояснить природу такого расхождения
5. Скорректировать заголовок раздела, посвящённого синаптофизину. Интерпретация в тексте переформулирована в соответствии с замечанием рецензента, однако подзаголовок «Увеличение синаптогенеза в нейронах энтеральной нервной системы» сохраняет прежнюю трактовку, из-за которой у рецензента первоначально и возникли вопросы.
6. Дополнить сведения о производителях антител, микроскопа и микротома указанием города (в дополнение к уже приведённой стране) в соответствии с правилами журнала.
7. Просим вычитать текст и устранить опечатки: запись уровней значимости в подписях к рисункам (сейчас <p 0,001 вместо р<0,001); в обсуждении есть предложение «Повышение активности GFAP в кишечнике, но более выраженно в толстой кишке.» - выглядит незаконченным; грамматические рассогласования числа («состояниЕ … подобнЫ», «данные изменениЯ указываЕт», «нарушения … может быть связано»).