Маркеры опухолевого микроокружения при инкубации биоптатов рака молочной железы

Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующие позиции среди злокачественных опухолей женского населения в мире. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), к концу 2020 г. в мире насчитывалось 7,8 млн женщин с РМЖ, диагностированным за последние 5 лет, что ставит эту форму рака на первое место по распространенности среди злокачественных новообразований¹. В силу широкой распространенности и неуклонного роста, социально-экономической значимости РМЖ остается важной проблемой современной онкологии.

В последние годы было установлено, что при РМЖ инфильтрирующие и ассоциированные с опухолью иммунные клетки обладают как противоопухолевой активностью, так и туморогенным эффектом [1][2][3]. Установлено, что происходящее в микроокружении опухоли (МкО) взаимодействие опухолевых и иммунных клеток сопровождается экспрессией целого ряда онкоассоциированных белков группы цитокинов. Данные иммуноонкологические маркеры влияют на дифференцировку, апоптоз, прогрессию опухоли, и их уровень изменяется при взаимодействии опухолевых и иммунных клеток в канцерогенезе [4][5][6]. Исследования цитокинового профиля проводятся в России и в мире. Так, Т.А. Кунц и соавт. [7] изучали цитокины: IL-2 (interleukin, интерлейкин), IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-18, IL-1β, IL-1Ra, IFN-γ (interferon gamma, интерферон-гамма), TNF-α (tumor necrosis factor alpha, фактор некроза опухоли-альфа), MCP-1 (мonocyte сhemoattractant рrotein 1, моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1), G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), VEGF (vascular endothelial growth factor, фактор роста эндотелия сосудов) в иммунокомпетентных клетках периферической крови и в опухоли при инвазивном протоковом РМЖ. Авторами выявлено статистически значимое повышение продукции изученных цитокинов (за исключением IL-18) под влиянием поликлональных активаторов только в клетках периферической крови.

Важны исследования факторов роста, в первую очередь VEGF и его рецепторов, для возможности применения в клинической практике. Продолжаются исследования совместного применения антиангиогенных препаратов с блокаторами контрольных точек при иммунотерапии рака. Эффективность комбинированной антиангиогенной и анти-PD-1 терапии была дополнительно оценена у пациентов с прогрессирующим тройным негативным РМЖ [8]. Изучение МкО в настоящее время позволило внедрить и использовать в клинике рецепторы PDL (programmed cell death 1; CD279) в качестве маркера для назначения иммунотерапии. Такие показатели, как р53, p63, цитокератины 5 и 6, гладкомышечный актин, PHH3 (phosphohistone H3, фосфогистон Н3), E-кадгерин, EGFR (epidermal growth factor receptor, рецептор эпидермального фактора роста), HNF-3A (hepatocyte nuclear factor 3-alpha, ядерный фактор гепатоцитов 3 альфа), рецепторы андрогенов, опухоль-ассоциированные лимфоциты, в исследованиях также демонстрируют прогностическую значимость [9][10][11]. Актуальность изучения медиаторов МкО не вызывает сомнений, поскольку полученные результаты важны не только для мониторинга и прогнозирования, но и для контроля за эффективностью лечения РМЖ [12][13].

Цель исследования: изучить спонтанную и стимулированную продукцию цитокинов в биоптатах РМЖ в зависимости от степени распространенности опухолевого роста.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальное исследование проведено с клеточными культурами биоптатов пациенток с РМЖ, проходивших лечение в ГУЗ «Областной клинический онкодиспансер» Саратовской области с 15.05.2017 по 12.10.2018.

Исследование одобрено локальным комитетом по Этике Саратовского медицинского университета «Реавиз» (протокол № 7 от 21.07.2017).

Диагноз РМЖ у всех пациенток установлен на основании клинического и инструментального обследования, включавшего: маммографию, ультразвуковое исследование молочных желез, органов брюшной полости и малого таза, а также рентгенографию органов грудной клетки, морфологическую и иммуногистохимическую верификацию типа опухоли.

Критерии включения в исследование:

• возраст 18 лет и старше;
• РМЖ: стадия заболевания Т1-4N0-2M0-1;
• подписанное информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии невключения:

• злокачественные образования других локализаций;
• сопутствующая соматическая патология в стадии декомпенсации.

Критериям включения соответствовали 30 пациенток с РМЖ (медиана возраста 57 лет, интерквартильный размах: 46; 62 года), которые были разделены на две группы: в первую включены 15 женщин с локальным РМЖ (I–II стадий), во вторую группу 15 пациенток с местно-распространенным опухолевым ростом и метастатическим РМЖ (III–IV стадий) (рис.).

В контрольную группу вошли 6 практически здоровых женщин (медиана возраста 56,5 года; интерквартильный размах: 47; 62 года), поступивших в частную клинику пластической хирургии г. Саратова с целью выполнения эстетической операции – мастопексии (у 2 в сочетании с редукционной маммопластикой) и подписавших информированное согласие на участие в исследовании. У всех в анамнезе отсутствовали злокачественные новообразования и на момент оперативного вмешательства не отмечалось декомпенсации сопутствующей соматической патологии (рис.).

Забор биологического материала

У пациенток группы 1 образцы опухоли получали во время оперативного вмешательства, у пациенток группы 2 выполнялась трепанобиопсия опухоли с использованием полуавтоматических игл GBL 14/10 (Bloodline S.p.A., Италия). Взятие биоптатов проводилось до назначения системной терапии. У женщин контрольной группы образцы ткани молочной железы взяты во время выполнения пластической операции. Объем образцов опухоли/биоптатов для последующей инкубации и оценки цитокинпродуцирующего потенциала опухоли и МкО составлял в среднем 8 мм³.

Гистологическое исследование материала проведено по стандартной методике с окрашиванием гематоксилин-эозином. Схема описания включала гистологический вариант опухоли, степень дифференцировки (градация, G), наличие структур карциномы in situ, васкулярной инвазии, интраневральной инвазии, статуса лимфатических узлов, краев резекции. Для определения гистологической формы опухоли использовалась классификация ВОЗ 2012 года. Всем пациенткам проведено иммуногистохимическое исследование опухолевой ткани с определением экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона, белка HER-2-neo, фактора пролиферации Ki 67 c использованием коммерческих моноклональных антител (Dako, Дания). Исследование выполнялось согласно инструкции фирмы-производителя с постановкой реакций на контрольных срезах.

Степень васкуляризации оценивалась полуколичественно в десяти полях зрения: слабая васкуляризация – 1 балл (сосуды занимают 1/3 поля зрения), умеренная – 2 балла (сосуды занимают 1/2 поля зрения), выраженная – 3 балла (сосуды занимают не менее 2/3 поля зрения).

Для стимуляции продукции цитокинов применяли комплекс поликлональных активаторов (ПА), состоящий из фитогемагглютинина в концентрации 4 мкг/мл, конканавалина А в концентрации 4 мкг/мл и липополисахарида в концентрации 2 мкг/мл. В исследовании использовали стандартизованный набор реагентов «Цитокин-стимул-бест» производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирская область, р. п. Кольцово, Россия).

Исследование медиаторов

Образцы / биоптаты опухоли помещали в 2 флакона, в одном из которых находилась только питательная среда DMEM-F12 (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., США) – для определения спонтанной продукции, а в другом – раствор ПА в таком же объеме среды (продукция, индуцированная ПА). Инкубирование производили при 37 °С в течение 72 ч. Для получения очищенного супернатанта оставшиеся клетки опухоли осаждали центрифугированием со скоростью 2000 об/мин. в течение 15 мин.

В супернатантах после осаждения клеток крови и опухоли с помощью иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест» определяли концентрацию TNF-α, IFN-γ, G-CSF, GM-CSF, VEGF, MCP-1, TGF-β1 (transforming growth factor beta1, трансформирующий фактор роста бета1).

Набор приведенных медиаторов был выбран с целью исследования их продукции и роли в онкогенезе. Данная группа цитокинов включает колониестимулирующие факторы, факторы роста, интерферон, хемокин, фактор некроза опухоли, выполняющие различные функции в иммунном ответе. Это позволило изучить особенности МкО на разных стадиях опухоли.

Определялся индекс влияния поликлональных активаторов (ИВПА) на продукцию иммуноонкологических маркеров МкО. Для расчета ИВПА применяли формулу: А/Б, где А – концентрация стимулированной ПА продукции маркера, пг/мл; Б – концентрация спонтанной продукции маркера, пг/мл.

Статистический анализ

Для проверки гипотез на нормальность при изучении непрерывных переменных применялись критерии Колмогорова – Смирнова и Шапиро – Уилка. Изученные параметры не соответствовали нормальному распределению. Данные представлены как медиана и 25–75-й процентили. Для сравнения групп применяли методы непараметрического анализа: критерий Манна – Уитни и медианный критерий для независимых выборок с попарным сравнением. Качественные признаки представлены в виде абсолютного числа пациенток с данным признаком и доли от общего числа, выраженной в процентах. Для сравнения частот качественных признаков в группах использовали критерий хи-квадрат и точный критерий Фишера. Для множественных сравнений применяли поправку Данна. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Данные обрабатывались с помощью программы IBM SPSS v.23.0 (SPSS: An IBM Company, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исходные характеристики групп

Результаты морфологического исследования биоптатов опухолевой ткани представлены в таблице 1.

Группы не различались по возрасту, гистологическому варианту и иммуногистохимическому типу опухоли. Преобладал преимущественно инвазивный рак без признаков специфичности.

У пациенток группы 2 статистически значимо чаще отмечалась выраженная степень васкуляризации: у 6 (40%) пациенток против 1 (7%) в группе 1. У всех пациенток в группе 2 выявлена лимфоваскулярная инвазия, в группе 1 – только у 2 (13%), р < 0,05. Метастазы в регионарных лимфатических узлах (N1-2) обнаружены только в группе 2: у 10 (67%) пациенток.

Цитокинпродуцирующий потенциал опухоли

Исследование цитокинпродуцирующего потенциала клеток опухоли (спонтанной и при воздействии ПА) позволило установить, что в процессе инкубации происходит значимое изменение концентрации определяемых медиаторов в опухолевой ткани по сравнению с неизмененной тканью молочной железы, за исключением уровня IFN-γ.

Результаты исследования спонтанной продукции цитокинов представлены в таблице 2.

Установлено, что спонтанная продукция определяемых цитокинов биоптатами РМЖ в обеих группах отличается высокой активностью по сравнению с группой контроля, за исключением IFN-γ, спонтанная продукция которого статистически значимо увеличивалась только в группе 1 по сравнению с контрольной. При этом биоптаты каждой из выделенных двух групп отличала разная степень нарастания уровня исследуемых показателей.

В образцах опухоли из группы 1 по сравнению с группой контроля отмечено статистически значимое повышение спонтанной продукции: TNF-α в 4,2, IFN-γ в 3,6, MCP-1 в 6,7 раза, факторов роста: TGF-β1 – в 2,2 раза, VEGF – в 11,9 раза; максимальное увеличение отмечено для колониестимулирующих факторов: GМ-CSF – в 15,6 раза, G-CSF – в 96,8 раза.

В трепанобиоптатах опухолевой ткани в группе 2 по сравнению с контрольной группой концентрация спонтанной продукции цитокинов была статистически значимо выше: TNF-α – в 4,8 раза, MCP-1 – в 6,3 раза, TGF-β1 – в 2,5 раза, VEGF – в 14,6 раза, GМ-CSF – в 13,4 раза, G-CSF – в 79,5 раза.

При проведении сравнений между группами 1 и 2 статистически значимые отличия выявлены для следующих цитокинов: концентрация МСР-1 и IFN-γ была выше в группе 1, VEGF и TGF-β1 – в группе 2.

В супернатанте клеток молочной железы из группы контроля добавление ПА приводило к повышению уровня медиаторов в диапазоне от 1,1 до 3,1 раза по сравнению с исходными величинами. При добавлении ПА в среду культивирования опухолевых клеток продукция TNF-α, G-CSF, VEGF и TGF-β1 изменялась более выраженно по сравнению со здоровой тканью молочной железы; для этих цитокинов определены более высокие значения ИВПА (табл. 3).

Между группами 1 и 2 установлены статистически значимые различия по ИВПА для G-CSF, VEGF, TGF-β1: в группе 2 отмечались более высокие значения этих цитокинов. Уровень IFN-γ в группе 2 повышался менее значительно, чем в группе контроля.

ОБСУЖДЕНИЕ

Процессы, приводящие к перепрограммированию иммунного МкО при РМЖ, в настоящее время приобретают большое значение для разработки новой терапевтической стратегии, направленной на «нормализацию» окружающей опухоль стромы, а также на модуляцию иммунной системы с целью усиления противоопухолевой активности.

Высокая цитокин-продуцирующая активность при спонтанной и индуцированной ПА продукции у пациенток с изученными стадиями РМЖ в сравнении с неизмененными клетками молочной железы может характеризовать структурно-функциональные изменения МкО и подтверждают значение иммунной системы в контроле за пролиферацией опухолевых клеток.

Биоптаты пациенток группы 1 (при локальном опухолевом росте) характеризовались увеличением спонтанной продукции TNF-α, IFN-γ, MCP-1, GМ-CSF, G-CSF, что является следствием контроля иммунной системы над ростом опухоли с усилением противоопухолевой активности. TNF-α – это плейотропный цитокин, играющий противоречивую роль. На начальных стадиях опухолевого роста индуцирует активацию иммунного ответа за счет влияния на макрофаги, дендритные клетки, естественные киллеры (NK-клетки) и В- и Т-лимфоциты, в МкО является одним из основных медиаторов воспаления. TNF-α участвует в дифференцировке иммуносупрессорных клеток, что приводит к уклонению от опухолевого иммунного надзора. Повышение уровня TNF-α, с одной стороны, сопровождает индукцию апоптоза, с другой – стимулирует неоангиогенез, вызывает усиление гибели лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль. В итоге происходит усиление пролиферации и распространения опухолевых клеток. Такой двойственный механизм действия характерен для ряда компонентов МкО [14]. По мнению Madhusudan S. и соавт.: «Воспаление, способствующее инвазивности и индуцирующее иммуносупрессию, является одним из признаков МкО прогрессирующих опухолей» [15].

Усиление спонтанной продукции МСР-1 супернатантов можно считать результатом процессов, приводящих к поляризации макрофагов с образованием опухоль-опосредованных макрофагов (М1 и М2). По данным ряда исследований, М1 препятствует пролиферации опухолевой ткани, а М2 на фоне иммуносупрессии стимулируют ангиогенез, что способствует миграции и инвазии опухолевых клеток. Индуцированная ПА экспрессия МСР-1 также является подтверждением нарушенной функциональной активности макрофагов и образования макрофагов М2 [16]. Обнаруженное повышение в группе 1 уровня факторов роста по сравнению с контрольной группой свидетельствует о пролиферации опухоли и стимуляции ангиогенеза на начальных стадиях злокачественного процесса.

Цитокинпродуцирующая активность биоптатов в группе 2 (при распространенном опухолевом росте) по сравнению с группой 1 характеризуется более высоким уровнем факторов роста (VEGF и TGF-β1), ИВПА этих факторов и G-CSF. При этом различий как по спонтанной, так и индуцированной продукции TNF-α, MCP-1 и GМ-CSF в зависимости от стадии не установлено. Уровень IFN-γ при распространенном росте при спонтанной инкубации статистически значимо ниже уровня локального роста, а при индуцированной продукции ниже ИВПА нормальной ткани, что, возможно, свидетельствует о нарушении иммунной защиты организма на фоне опухолевой прогрессии.

Полученные результаты дают основание считать, что нарастание способности опухолевой ткани к миграции и инвазии сопровождается дисрегуляцией цитокиновой сети. Медиаторы МкО представляют собой сложную сеть клеточной передачи сигналов и свойств опухолевых клеток. Цитокины, подавляющие иммунные клетки, на начальных этапах опухолевого роста препятствуют эффективному противоопухолевому иммунитету [17]. Первоначальное, характерное для воспалительного процесса, повышение цитокинпродуцирующей активности TNF-α, IFN-γ, MCP-1, GМ-CSF, G-CSF становится одним из условий развития метастатического процесса при РМЖ [18].

Высокий уровень спонтанной продукции колониестимулирующих факторов, прежде всего G-CSF, активирует выработку факторов роста. Повышение содержания TGF-β1 подтверждает развитие иммунной супрессии, эпителиально-мезенхимального перехода, индукцию экспрессии VEGF. Рост продукции VEGF, как при спонтанной, так и при индуцированной ПА инкубации на распространенных стадиях подтверждает значение факторов роста в опухолевой прогрессии и развитии неоангиогенеза. Усиление продукции факторов роста свидетельствует, что основой метастатического процесса у больных РМЖ становится развитие эпителиально-мезенхимального перехода и активация ангиогенеза. Эпителиально-мезенхимальный переход при РМЖ связан с присутствием ассоциированных с раком фибробластов, экспрессирующих активированную передачу сигналов TGF-β1 [18]. Цитокин TGF-β1 является основным медиатором подавления иммунитета в МкО и играет центральную роль в ингибировании как адаптивных, так и врожденных иммунных ответов во время опухолевой прогрессии. Компоненты измененного МкО действуют совместно, препятствуя эффективному противоопухолевому иммунитету, способствуя прогрессированию и метастазированию злокачественных клеток [15]. МкO при РМЖ можно считать критическим элементом развития и прогрессирования опухоли.

Следует отметить, что изученные группы представляли наиболее типичный возраст для пациенток с РМЖ, группы не различались по гистологическому варианту и иммуногистохимическому типу опухоли, что позволило провести сравнение между ними. Однако необходимо учитывать, что среди пациенток преобладал инвазивный рак без признаков специфичности и результаты исследования могут быть интерпретированы с учетом этих особенностей. К ограничениям исследования также относится небольшое количество пациенток в группах, различия между группами в выраженности васкуляризации и частоте лимфоваскулярной инвазии, что может влиять на цитокиновый профиль супернатантов. Для определения прогностической ценности иммуноонкологических маркеров требуются дальнейшие клинические исследования

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Продукция цитокинов (TNF-α, MCP-1, GМ-CSF, G-CSF, VEGF, TGF-β1) в биоптатах РМЖ значительно выше, чем в биоптатах неизмененной молочной железы. Уровень спонтанной и индуцированной продукции зависит от стадии: для прогрессирования и диссеминации опухолевого процесса характерна наибольшая продукция факторов роста, VEGF и TGF-β1.