Визуализация дискретных нанофосфоров в биологических системах с учетом времени жизни флуоресценции

Цель. Продемонстрировать новый метод лазерной сканирующей многофотонной микроскопии, подходящий для быстрого получения изображений образцов, меченных фосфоресцирующими материалами, характеризующихся длительным временем жизни излучения, измеряемым в микросекундах. Представленная микроскопия представляет собой прогресс по сравнению с существующими методами лазерного сканирования, в которых получение изображений фосфоресцирующих материалов занимает непрактично долгое время.
Материал и методы. Описанный метод основан на быстром сканировании сфокусированного луча возбуждения по образцу при непрерывной регистрации фотолюминесцентного (PL) сигнала. Полученные изображения дискретных фосфоресцирующих наночастиц выглядели размытыми. Изображение с дифракционным разрешением было восстановлено с использованием алгоритма деконволюции, где время жизни PL было ключевым входным параметром. Для тестирования метода были синтезированы два типа апконверсионных частиц (UCNP): NaYF₄:Yb³+:Er³+/ NaYF₄ (E-UCNP), β-NaYF₄:Yb³+,Tm³+/NaYF₄ (T-UCNP) и использованы для проверки возможности демультиплексирования двух типов UCNP ex vivo, доставленных в печень лабораторной мыши.
Результаты. Полученные изображения E-UCNP, T-UCNP на фоне печени были полностью реконструированы и показали улучшенное отношение сигнал/шум. Кроме того, метод позволял быстро (в масштабе секунд) получать время жизни PL UCNP и четко различать два типа UCNP.
Заключение. Мы продемонстрировали новый подход для быстрого получения изображений PL-образцов, содержащих флуоресцирующие вещества, например биологических образцов, меченных дискретными UCNP. Было показано, что размытые изображения восстанавливаются на этапе постобработки путем применения процедуры деконволюции. Это позволило продемонстрировать мультиплексирование/демультиплексирование в режиме визуализации времени жизни, где время жизни определялось синтезом UCNP и восстанавливалось во время получения многофотонного изображения с помощью алгоритма деконволюции. Возможности этого метода были продемонстрированы на примере идентификации двух типов UCNP, накопленных в печени лабораторного животного. Мы считаем, что продемонстрированный метод может быть полезен для быстрой прижизненной визуализации, когда требуется несколько молекулярно-специфических меченых агентов.

1. Moerner W.E. New directions in single-molecule imaging and analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Jul 31; 104 (31): 12596– 602. https://doi.org/10.1073/pnas.0610081104. Epub 2007 Jul 30. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Sep 25; 104 (39): 15584. PMID: 17664434.

2. Gómez D.E., van Embden J., Jasieniak J., et al. Blinking and surface chemistry of single CdSe nanocrystals. Small. 2006 Feb; 2(2): 204–8. https://doi.org/10.1002/smll.200500204. PMID: 17193021.

3. Altman R.B., Terry D.S., Zhou Z., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 2011 Nov 13; 9(1): 68–71. https://doi.org/10.1038/nmeth.1774. PMID: 22081126.

4. Hell S.W. Far-field optical nanoscopy. Science. 2007 May 25; 316 (5828): 1153–8. https://doi.org/10.1126/science.1137395. PMID: 17525330.

5. Sreenivasan V.K., Zvyagin A.V., Goldys E.M. Luminescent nanoparticles and their applications in the life sciences. J Phys Condens Matter. 2013 May 15; 25(19): 194101. https://doi.org/10.1088/09538984/25/19/194101. Epub 2013 Apr 24. PMID: 23611923.

6. Edmonds A.M., Sobhan M.A., Sreenivasan V.K., et al. Nano-ruby: a promising fluorescent probe for background-free cellular imaging. Particle & Particle Systems Characterization. 2013; 30(6): 506–13. https://doi.org/10.1002/ppsc.201200112.

7. Yu S.J., Kang M.W., Chang H.C., et al. Bright fluorescent nanodiamonds: no photobleaching and low cytotoxicity. J Am Chem Soc. 2005 Dec 21; 127(50): 17604–5. https://doi.org/10.1021/ja0567081. PMID: 16351080.

8. Yuan J., Wang G. Lanthanide-based luminescence probes and time-resolved luminescence bioassays. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2006; 25(5): 490–500. https://doi.org/10.1016/j.trac.2005.11.013.

9. Nadort A., Sreenivasan V.K., Song Z., et al. Quantitative imaging of single upconversion nanoparticles in biological tissue. PLoS One. 2013 May 14; 8(5): e63292. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063292. PMID: 23691012.

10. Zhan Q., He S., Qian J., et al. Optimization of optical excitation of upconversion nanoparticles for rapid microscopy and deeper tissue imaging with higher quantum yield. Theranostics. 2013. Mar 23; 3(5): 306–16. https://doi.org/10.7150/thno.6007. PMID: 23650478.

11. Wu S., Han G., Milliron D.J., et al. Non-blinking and photostable upconverted luminescence from single lanthanide-doped nanocrystals. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jul 7; 106(27): 10917–21. https://doi.org/10.1073/pnas.0904792106. Epub 2009 Jun 18. PMID: 19541601.

12. Gainer C.F., Utzinger U., Romanowski M. Scanning two-photon microscopy with upconverting lanthanide nanoparticles via Richardson-Lucy deconvolution. J Biomed Opt. 2012 Jul; 17(7): 076003. https://doi.org/10.1117/1.JBO.17.7.076003. PMID: 22894486.

13. Pominova D.V., Ryabova A.V., Grachev P.V., et al. Upconversion microparticles as time-resolved luminescent probes for multiphoton microscopy: desired signal extraction from the streaking effect. J Biomed Opt. 2016 Sep 1; 21(9): 96002. https://doi.org/10.1117/1.JBO.21.9.096002. PMID: 27604561.

14. Kostyuk A.B., Guryev E.L., Vorotnov A.D., et al. Real-Time Tracking of Yb3+, Tm3+ Doped NaYF4 Nanoparticles in Living Cancer Cells. Sovremennye tehnologii v medicine 2018; 10(1): 57–63. http://doi.org/10.17691/stm2018.10.1.07.

15. Kostyuk A.B., Vorotnov A.D., Ivanov A.V., et al. Resolution and contrast enhancement of laser-scanning multiphoton microscopy using thulium-doped upconversion nanoparticles. Nano Res. 2019; 12: 2933–40. https://doi.org/10.1007/s12274-019-2527-0.

16. Fan Y., Wang P., Lu Y., et al. Lifetime-engineered NIR-II nanoparticles unlock multiplexed in vivo imaging. Nat Nanotechnol. 2018 Oct; 13(10): 941–6. https://doi.org/10.1038/s41565-018-0221-0. Epub 2018 Aug 6. PMID: 30082923.

17. Johnson N.J., Korinek A., Dong C., van Veggel F.C. Self-focusing by Ostwald ripening: a strategy for layer-by-layer epitaxial growth on upconverting nanocrystals. J Am Chem Soc. 2012 Jul 11; 134(27): 11068–71. https://doi.org/10.1021/ja302717u. Epub 2012 Jun 26. PMID: 22734596.

18. Rocheva V.V., Koroleva A.V., Savelyev A.G., et al. Highresolution 3D photopolymerization assisted by upconversion nanoparticles for rapid prototyping applications. Sci Rep. 2018 Feb 26; 8(1): 3663. https://doi.org/10.1038/s41598-018-217930. PMID: 29483519.

19. Hehlen M., Kuditcher A., Lenef A., et al. Nonradiative dynamics of avalanche upconversion in Tm: LiYF4. Physical Review B. 2000; 61(2): 1116. https://doi.org/10.1103/PhysRevB.61.1116

20. Zhao J., Jin D., Schartner E.P., et al. Single-nanocrystal sensitivity achieved by enhanced upconversion luminescence. Nat Nanotechnol. 2013 Oct; 8(10): 729–734. https://doi.org/10.1038/nnano.2013.171. Epub 2013 Sep 1. PMID: 23995455.