Прекондиционирование креатин фосфатом уменьшает ишемическо-реперфузионное повреждение изолированного сердца крысы

Ишемия миокарда подразумевает снижение снабжения сердца кислородом, что может вызвать ряд функциональных, биохимических и морфологических изменений. В результате ишемии наблюдаются снижение сократительной способности миокарда, развитие систолической и диастолической дисфункции, аритмий [1][2].

При ишемическо-реперфузионном повреждении значительный вклад в развитие сердечной дисфункции вносит повышение уровня окислительного стресса за счет резкого увеличения образования прооксидантов, которые вызывают свободнорадикальное повреждение. Последнее также может влиять на воспаление и, следовательно, еще больше усугублять повреждение миокарда [3][4].

Термин «ишемическое прекондиционирование» был впервые введен в 1986 году и относится к стратегии воздействия на сердце кратковременных эпизодов ишемии с целью повышения толерантности миокарда к прекращению кровоснабжения и доставки кислорода [5]. Считается, что в основе прекондиционирования лежат два кардиопротективных механизма: первый, который проявляется в течение первых 2–3 часов после эпизода ишемии, и второй, который начинается через 12–24 часа и длится около 4 дней, защищая миокард от инфаркта, сердечной недостаточности и желудочковых аритмий, вызванных ишемией и реперфузией, за счет улучшения сократительной способности миокарда, а также уменьшения накопления и адгезии нейтрофилов и предотвращения апоптоза миоцитов [6]. Однако, учитывая, что клиническое применение ишемического прекондиционирования ограничено, все большее внимание ученых сосредоточено на применении безопасных фармакологических веществ, которые будут вводиться до ишемии и которые бы, подобно ишемическому прекондиционированию, достигали кардиопротекции [7]. Имеющиеся литературные данные указывают на то, что большое количество веществ может имитировать процессы, вызванные ишемическим прекондиционированием, и в связи с этим может использоваться для фармакологического прекондиционирования [7][8].

Учитывая, что креатин фосфат (КФ) является первой молекулой, потребляемой при ишемии, гипоксии и токсической кардиомиопатии, и что в условиях гипоксии поглощение экзогенно вводимого КФ увеличивается [9], возникает вопрос, будет ли однократное введение этого вещества защищать миокард от повреждения. Именно поэтому целью данного исследования было изучение влияния однократного введения КФ непосредственно перед ишемией на кардиодинамические параметры и параметры окислительного стресса в коронарном венозном оттоке ретроградно перфузированного изолированного сердца крысы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Данное экспериментальное исследование проводилось на животных в условиях ex vivo. При экспериментальной работе соблюдались положения «EU Directive for the Protection of the Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes 86/609 / EES» и принципы этики¹. Исследование было одобрено Комитетом по защите благополучия лабораторных животных факультета медицинских наук Крагуевацкого университета, решение № 015722 от 15.07.2020.

Для исследования влияния КФ на ишемическореперфузионное повреждение сердца использовали 20 здоровых крыс Wistar albino coja мужского пола в возрасте 8 недель, массой тела 200–250 г. Крыс содержали в полипропиленовых клетках, заполненных слоем белой сосновой стружки, в постоянно контролируемой среде (температура (22 ± 1 °C), влажность (55 ± 10%), 12/12-часовой цикл свет/темнота) в Институте сердечно-сосудистой физиологии факультета медицинских наук, Крагуевацкий университет, Сербия. Все животные имели свободный доступ к пище и воде – ad libitum.

После анестезии кетамином (10 мг/кг) и ксилазином (5 мг/кг) животных выводили из эксперимента путем смещения шейных позвонков (Приложение 1 к животным / научным процедурам, Закон 1986 г., Великобритания). Исследование функции сердца ex vivo проводилось с использованием модели ретроградной перфузии изолированного сердца по Лангендорфу (Langendorff apparatus, Experimetria Ltd, 1062 Budapest, Hungary). Методика исследования подробно описана в наших предыдущих исследованиях [10].

После 20-минутного периода стабилизации 10 сердец, которые были отнесены к контрольной группе, подвергались ишемическо-реперфузионному повреждению, которое включало глобальную ишемию путем полного закрытия потока на аппарате Лангендорфа, так что как раствор Кребса – Хенселейта, так и кислород не достигали сердца в течение 20 минут, а затем в течение 30 минут проводилась реперфузия. Другие 10 сердец, которые были отнесены к экспериментальной группе, подвергались стабилизации в течение 20 мин, прекондиционированию КФ в дозе 0,2 ммоль/л в течение 5 минут с помощью инфузионного насоса через сердце, после чего вызывалось ишемическо-реперфузионное повреждение по способу, аналогичному для контрольной группы (рис.).

Существует очень мало исследований, изучавших влияние введения КФ непосредственно в сердце. В исследованиях по изучению системных эффектов КФ доза для крыс составляет обычно около 200 мг/кг. В одном из недавно опубликованных исследований внутривенно вводили КФ в дозе 20 ммоль [11]. В нашем исследовании выбрана в 100 раз меньшая доза, учитывая непосредственное введение КФ в коронарный кровоток.

Во время эксперимента наблюдались и регистрировались следующие кардиодинамические параметры: dp/dt max (максимальная скорость развития давления в левом желудочке, мм рт. ст./с), dp/dt min (минимальная скорость развития давления в левом желудочке, мм рт. ст./с), систолическое давление в левом желудочке (СДЛЖ, мм рт. ст.), диастолическое давление в левом желудочке (ДДЛЖ, мм рт. ст.) и частота сердечных сокращений (ЧСС, уд./мин). Кровоток через коронарные кровеносные сосуды выражался в мл/мин и измерялся флуориметрическим методом путем суммирования венозного оттока из коронарных кровеносных сосудов сердца.

Для изучения влияния КФ на выработку прооксидантов в сердце в образцах коронарного венозного оттока спектрофотометрическим методом на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Specord S-600 Analytik Jena, Германия) определяли: концентрацию нитритов (NO₂^–), супероксидного анион-радикала (O₂^–) и перекиси водорода (H₂O₂), рассчитывали индекс перекисного окисления липидов (ИПОЛ). Основа для использования этих методик и сами методики описаны нами более подробно в предыдущей публикации [10].

Статистический анализ

Во время экспериментального протокола изученные параметры определялись во время стабилизации, а также на 1-й и 30-й минутах реперфузии. Все полученные результаты для групп представлены в виде долей, выраженных в процентах со стандартным отклонением, относительно данных последней минуты точки стабилизации соответствующей группы, которая принималась за 100%. Для сравнения значений между указанными точками использовали критерий Вилкоксона. При проверке нулевых гипотез принят уровень значимости р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Кардиодинамические параметры и коронарный кровоток

Полученные результаты представлены в таблице 1.

В контрольной группе, начиная с 1-й минуты реперфузии, уменьшались: dp/dt max, dp/dt min, СДЛЖ, к 30-й минуте эти параметры продолжали снижаться; ДДЛЖ увеличивалось в 1,9 раза во время 1-й минуты реперфузии и снижалось в 2 раза по сравнению с периодом стабилизации к 30-й минуте.

В экспериментальной группе с 1-й минуты реперфузии отмечено уменьшение dp/dt min, которая имела тенденцию к повышению к 30-й минуте. Другие кардиодинамические показатели – dp/dt max иСДЛЖ – повышались на 1-й минуте реперфузии и снижались к 30-й минуте. ДДЛЖ увеличивалось в 1,2 раза во время 1-й минуты реперфузии и снижалось в 1,3 раза к 30-й минуте по сравнению с периодом стабилизации.

Динамика коронарного кровотока и ЧСС была аналогичной в обеих группах: ЧСС начинала снижаться на 1-й минуте, и показатели достигали минимума к 30-й минуте; коронарный кровоток существенно неизменялся на 1-й минуте и снижался к 30-й минуте.

Значения обоих параметров, отражающих сократительную способность миокарда (dp/dt max и dp/dt min), через 30 минут от периода реперфузии были статистически значимо выше, чем значения, зарегистрированные в контрольной группе, в 1,7 и в 1,9 раза соответственно. Вместе с этим изменение значений СДЛЖ по сравнению со значениями, зарегистрированными в точке стабилизации, было статистически значимо выше и на 1-й, и на 30-й минутах реперфузии по сравнению с контрольной группой в 1,4 и в 1,5 раза соответственно. Одновременно на первой минуте реперфузии значения ДДЛЖ были статистически значимо ниже (в 1,6 раза) в экспериментальной, чем в контрольной группе. В контрольной группе наблюдалось выраженное снижение значений ДДЛЖ, так что в конце реперфузии оно было ниже в 1,6 раза, чем в экспериментальной группе.

Параметры окислительного стресса

Значения параметров окислительного стресса представлены в таблице 2.

В контрольной группе на 1-й минуте реперфузии происходило повышение концентрации параметров окислительного стресса, к 30-й минуте концентрация трех из них (NO₂^–, O₂^– и Н₂O₂) продолжала увеличиваться. В экспериментальной группе на 1-й минуте реперфузии отмечено снижение O₂^– и Н₂O₂ и отсутствие выраженных изменений NO₂^– и ИПОЛ. К 30-й минуте в этой группе продолжилось снижение NO₂^–, концентрация Н₂O₂ и ИПОЛ существенно не изменились, содержание O₂^– повысилось, но существенно не превышало значений в точке стабилизации.

Значения ИПОЛ, NO₂^–, O₂^– и Н₂O₂ были статистически значимо ниже в период реперфузии в экспериментальной группе по сравнению со значениями, зарегистрированными в контрольной группе как после 1-й минуты (в 1,2, 1,4, 2,8 и 1,9 раза соответственно), так и после 30-й минуты (в 1,3, 2,1, 1,9 и 2,1 раза соответственно).

ОБСУЖДЕНИЕ

Введение КФ в дозе 0,2 ммоль/л непосредственно перед началом ишемии сопровождалось увеличением значений dp/dt max и снижением dp/dt min по сравнению с периодом стабилизации. Менее выраженные изменения параметров сердечной функции указывают на значительную роль КФ в процессе прекондиционирования сердца. Положительное влияние КФ на диастолическую функцию сердца чрезвычайно важно, потому что фаза релаксации определяет наполнение сердца и, в конечном итоге, его работу.

Кардиопротекторные эффекты КФ, продемонстрированные в нашем исследовании, согласуются с предыдущими исследованиями. В частности, ранее на модели кроликов и свиней наблюдалось влияние КФна сердца, подвергшиеся ишемии. Было отмечено, что введение указанного агента приводит к значительному уменьшению области некроза сердца и защите сарколеммы от необратимого повреждения [13]. Кроме того, когда КФ вводили за 5 минут до ишемии в дозе до 200 мг/кг, наблюдалось значительное снижение повреждения миокарда [14].

Другая группа авторов показала, что парентеральное введение КФ незадолго до ишемии миокарда вызывало лучший сократительный ответ миокарда и сохраняло уровень аденозинтрифосфата (АТФ) по сравнению с сердцами крыс, получавших физиологический раствор [9]. Кроме того, было показано, что прекондиционирование сердца КФ сохраняет запасы КФ и АТФ. Однако существенным недостатком данного исследования является то, что оно не отслеживало сократительную функцию сердца.

Механизмы, которые могут объяснить наблюдаемые защитные эффекты в нашем исследовании, включают участие КФ в энергетическом метаболизме клетки, влияние на стабилизацию мембраны имикроциркуляцию. КФ стабилизирует мембрану кардиомиоцитов, взаимодействуя с мембранными фосфолипидами, связывая противоположно заряженную группу с заряженной группой фосфолипидов. Благоприятное влияние КФ на микроциркуляцию объясняется тенденцией ингибировать агрегацию тромбоцитов путем быстрого удаления аденозиндифосфата [13][18]. Кроме того, экзогенное введение КФ может уменьшить накопление лизофосфатидилхолина и лизофосфатилэтаноламина в ишемической клетке сердца. Таким образом, значительно снижается и предотвращается возникновение потенциально смертельных аритмий [9].

В нашем исследовании в контрольной группе наблюдался значительный скачок концентрации H₂O₂, O₂^– и NО₂^– в период реперфузии по сравнению со значениями в периоде стабилизации. Прекондиционирование КФ предотвращало увеличение измеряемых прооксидантов, тем самым защищая сердце от окислительного ишемическо-реперфузионного повреждения. В литературе сообщается, чтопосле воздействия ишемии на сердце и последующей реперфузии в кардиомиоцитах образуются O₂^–, тогда как в сосудистом русле – O₂^– и H₂O₂ [19].

В нашем исследовании основное внимание было уделено мониторингу уровней прооксидантов из коронарного венозного оттока без учета антиоксидантных маркеров, которые изучались, в частности, в исследовании A. Shopit и соавт. [20], посвященном изучению влияния КФ на окислительный статус через определение уровней малонового диальдегида, глутатиона, супероксиддисмутазы in vitro и in vivo. Авторами отмечено, что введение КФ вызывает значительное снижение уровня малонового диальдегида и увеличение глутатиона и супероксиддисмутазы. Считается, что КФ увеличивает антиоксидантную способность миокарда и воздействует на сигнальные пути ядерного фактора транскрипции Nrf2 [20]. Следует иметь в виду, что обнаружение меньших количеств антиоксидантов также не обязательно означает,что произошло окислительное повреждение, но может указывать на то, что антиоксиданты удаляли прооксиданты и предотвращали повреждение тканей.

Роль эндогенного оксида азота (NO) в ишемическо-реперфузионном повреждении противоречива, и трудно объяснить, где граница между защитными и потенциально вредными эффектами. В частности, снижение биоиспользования NO может поставить под угрозу процесс расслабления артерий и изменить функцию эндотелия. Снижение концентрации NO₂^– в качестве косвенного маркера NO в нашем исследовании под влиянием КФ указывает на вклад этого соединения в улучшение эндотелиальной функции [21]. Результаты подтверждают, что активация эндотелиальной синтазы NO в ишемическо-реперфузионном повреждении приводит к увеличению синтеза и высвобождению NO в условиях пониженной концентрации прооксидантов. С другой стороны, когда присутствуют высокие концентрации активных форм кислорода, избыточное количество NO будет реагировать с O₂^– и образовывать токсичный радикал пероксинитрита (ONOO^–), который усугубляет сердечную дисфункцию [22].

На настоящий момент в стратегии прекондиционирования окислительно-восстановительная передача сигналов еще недостаточно исследована и остается предметом изучения будущих исследований. Тем не менее было подтверждено, что временные низкие концентрации прооксидантов могут запускать механизмы защиты сердца и что передача сигналов активных форм кислорода во время прекондиционированияи во время фазы ранней реперфузии делает сердце устойчивым к реперфузионному повреждению [23]. До сих пор не было точно объяснено, может ли фармакологическое прекондиционирование помочь избежать массового производства активных форм кислорода и открытия митохондриальных каналов или просто смягчить эти процессы. Ранее описанное влияние КФ на митохондриальные каналы, вероятно, также отражается на окислительно-восстановительном статусе сердца, наблюдаемом в нашем исследовании.

Результаты исследований свидетельствуют о защитном эффекте введения КФ в коронарное русло непосредственно перед ишемией. Проведенное исследование имеет потенциальное практическое применение у пациентов, которым необходимо провести процедуру, вызывающую ишемию с последующей реперфузией миокарда. Что касается исследовательской модели, было бы интересно и, таким образом, ближе креальной ситуации, применить КФ на коронарных сосудах, а затем вызвать инфаркт или кардио­плегию in vivo. Принимая во внимание, что исследование проводилось на животной модели, возможны трансляционные исследования пациентов, перенесших операцию на сердце.

ВЫВОДЫ

Введение КФ в коронарный кровоток за 5 минут до индукции ишемии оказывает защитное действие на сократительную способность миокарда в модели изолированного сердца крысы; протективное действие в отношении сохранения показателей СДЛЖ и ДДЛЖ на значениях, более близких к исходным показателям, по сравнению с контрольной группой. Одним из механизмов защитного действия КФ может рассматриваться уменьшение окислительного стресса и окислительного повреждения.

ВКЛАД АВТОРОВ

Л.А. Гаджиева внесла значительный вклад в разработку концепции идеи, проведение исследования и обработку данных, подготовку рукописи. С.Б. Болевич внес основной вклад в разработку концепции идеи и методологии проведения эксперимента, а также написание текста статьи, окончательно утвердил публикуемую версию статьи и согласен принять на себя ответственность за все аспекты работы. В. Яковлевич внес основной вклад в разработку концепции идеи и методологии проведения эксперимента. И.А. Омаров проводил статистическую обработку результатов исследования и участвовал в разработке методологии проведения исследования и редактировании текста статьи. Х.А. Ордашев и М.К. Карташова участвовали в обработке данных и редактировании текста статьи. Все авторы утвердили окончательную версию статьи.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

Luiza A. Gadjieva: study concept and design, acquisition of data, analysis and interpretation of data, drafting of the manuscript. Sergey B. Bolevich: study concept and design of the experiment, drafting of the manuscript, approved the final version of the publication and agreed to take responsibility for all aspects of the work. Vladimir Jakovlevich: study concept and design of the experiment. Israpil A. Omarov: statistical analysis, development of the research methodology and drafting of the manuscript. Hasan A. Ordashev and Maria K. Kartashova: analysis and interpretation of data, drafting of the manuscript. All authors approved the final version of the publication.