Возрастная динамика структурно-функциональных взаимодействий нейронов стриатума в реализации актов двигательного поведения у крыс обоего пола

В ходе онтогенеза у крыс происходят значительные изменения в механизмах формирования поведения в соответствии с возрастом и структурой головного мозга. У крыс разных возрастных и половых групп гистологическое строение головного мозга отличается, что во многом определяет проявления их поведенческой активности [1].

Стриатум представляет собой структурное объединение подкорковых мозговых образований хвостатого ядра и скорлупы чечевицеобразного ядра, которые ответственны за эволюционно наиболее «древние» психомоторные функции. В то время как корковые структуры головного мозга координируют сложные двигательные акты и формируются в ходе онтогенеза значительно позже [2].

Определение соотношения морфологических характеристик, функциональной активности и количества нейронов в области базальных ганглиев (стриатума) в сравнении с ранее проведенными исследованиями моторной коры играет ключевую роль в понимании механизма колебания степени вовлеченности коры и подкорковых структур в локомоторную деятельность в ходе онтогенеза у крыс. Анализ этих механизмов позволит оценить динамику изменения поведенческих реакций крыс в возрастном и половом аспекте, что представляется особенно важным при проведении исследований с использованием крыс в качестве модельных объектов и при рассмотрении эволюционных вопросов развития структур головного мозга.

Цель исследования: оценить динамику структурно-функциональных взаимодействий нейронов стриатума в реализации актов двигательного поведения у крыс обоего пола разных возрастных групп.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные

Проведено экспериментальное исследование на 36 крысах линии Wistar: 18 самцов и 18 самок, разделенных по возрасту 2, 7 и 16 месяцев на 6 групп по 6 крыс в каждой [3]. Нами были отобраны животные соответствующего возраста, представляющие три возрастные категории: молодые, взрослые и старые крысы. Животные получены из филиала ФГБУН «НЦБМТ ФМБА» России – питомника «Андреевка». Исследование одобрено локальным этическим Комитетом Сеченовского университета, протокол № 03-19, 13 февраля 2019 г.

В работе соблюдались положения “EU Directive for the Protection of the Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes 86/609 / EES” и принципы этики¹.

Крыс содержали по 6 особей в стандартных поликарбонатных клетках объемом 16 300 см³. Все клетки были оборудованы стальными решетчатыми крышками с углублением для корма, стальными держателями этикеток, пластиковыми поилками с наконечниками. Кормление животных осуществляли с использованием сертифицированного сбалансированного гранулированного корма для грызунов (ООО «Лабораторкорм», Россия) ad libitum. Фильтрованную водопроводную воду давали ad libitum в стандартных автоклавированных питьевых бутылках со стальными наконечниками. Крысы находились в отдельных помещениях для содержания лабораторных животных в контролируемых условиях окружающей среды (20–26 °C при относительной влажности 30–70%). В комнатах содержания животных поддерживали 12-часовой цикл освещения и 10-кратную смену объема воздуха комнаты в час.

Оценка поведенческой активности крыс

Оценку актов двигательной активности проводили на приборе Laboras (Metris, Нидерланды), который представляет собой неинвазивную систему, автоматически распознающую и анализирующую такие поведенческие реакции лабораторных животных, как движение, неподвижность, вертикальная стойка, груминг, питье и прием пищи, локомоции [4]. В результате записи на приборе получаются данные по продолжительности и количеству вышеуказанных актов поведения. В нашем исследовании оценивалась двигательная активность за 15 мин.

Морфологическое исследование коры головного мозга

После записи поведенческих реакций животных усыпляли в газовой камере, осуществляли забор мозга.

Фиксацию кусочков головного мозга в жидкости Карнуа и окраску срезов осуществляли по методике, описанной нами ранее [5].

Подсчет количества и размера нейронов выполняли на микроскопе Axiolab с установленной камерой AxioCam и системой формирования изображений AxioVision (Carl Zeiss, Германия). Определение содержания нейронов в стриатуме мозга крыс с учетом возраста и пола проводили путем подсчета количества нейронов и их вертикального размера методами морфометрического анализа [6–8]. От каждого животного брали по два среза головного мозга, на которых проводили подсчет в 12 полях зрения. Идентификацию структур головного мозга крыс на соответствующих уровнях среза осуществляли по атласу G. Paxinos, C. Watson [9].

Статистический анализ

Оценку двигательной активности и подсчет количества и размера нейронов проводили в каждой из 6 групп. Нормальность распределения оценивалась с помощью критерия Колмогорова – Смирнова. Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25-й, 75-й процентили). Сравнение групп проводилось с помощью U-критерия Манна – Уитни.

Связь между признаками изучалась с использованием корреляционной зависимости, вычислялись коэффициенты корреляции и детерминации, сила связи оценивалась по шкале Чеддока. Коэффициент детерминации рассчитывался для подтверждения соответствия модели значениям полученных данных. Общие тенденции динамики изменения показателей рассчитывались в регрессионном анализе с построением тренда (линейного и полиномиального) [4]. Оценивали данные по количеству нейронов в стриатуме (12 усредненных значений) и результаты анализа двигательной активности (по 2 записи от каждого животного в группе).

Для статистической обработки данных использовали программное обеспечение: Microsoft Excel (Microsoft, США) и Origin Pro (Origin-Lab Corporation, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Морфологические особенности стриатума

В препаратах головного мозга, окрашенных крезиловым фиолетовым по методу Ниссля, на срезах вентральной части области базальных ганглиев отмечается большое количество поперечно ориентированных в каудальном направлении нервных волокон, между которыми расположены немногочисленные скопления нейронов, преимущественно округлой формы, со слабой прокраской цитоплазмы; отростки не контурируются. Максимальное содержание нейронов отмечается у 7-месячных самцов и постепенно уменьшается в процессе старения. Количество нейронов у самок возрастает несколько раньше и в дальнейшем незначительно снижается. В срезах мозга 7-месячных особей увеличивается количество нейронов пирамидной формы с цитоплазмой, содержащей базофильные гранулы. С возрастом в стриатуме происходит снижение общего числа нейронов (рис. 1).

Определение значений количественных и размерных показателей нейронов стриатума особей различных возрастных и половых групп позволяет проследить динамику развития базальных ганглиев у крыс в ходе онтогенеза. Согласно полученным данным, нейроны характеризуются неизменными размерами для любого пола и возраста.

Полученные данные (табл.) свидетельствуют о неоднородности количества нейронов стриатума для крыс разных возрастных и половых групп. Содержание нейронов базальных ганглиев у 2-месячных особей демонстрирует количественные колебания с незначительным уменьшением числа нейронов у 7-месячных крыс у самок, в то время как у самцов 7 месяцев, напротив, наблюдалось увеличение количества нейронов. К 16 месяцам наблюдалось общее снижение количества нейронов для животных обоего пола.

Двигательная активность

Запись двигательной активности позволила охарактеризовать локомоторное поведение крыс, а также сопоставить полученные данные с количеством нейронов в участках головного мозга, ответственных за регуляцию исследуемой формы поведения, в частности, стриатума.

В ходе исследования было выявлено, что максимальной подвижностью обладали 7-месячные самцы, а минимальной – 16-месячные животные обоих полов. Аналогичная закономерность была выявлена при подсчете среднего количества нейронов в группах: наименьший показатель наблюдался у 2-месячных крыс, наибольший – у 7-месячных животных; у 16-месячных особей он снижался и был сопоставим со значениями, определенными для молодых особей.

Зависимость между двигательной активностью и количеством нейронов стриатума

Для определения локомоторной активности крыс были использованы результаты записи подвижности. Корреляция этого параметра и количества нейронов в области стриатума отражена в графиках (рис. 2). У особей обоего пола наблюдается высокая прямо пропорциональная зависимость в возрасте 2 месяцев, у 7-месячных крыс она снижается, доходя до минимальных значений у 16-месячных животных.

В ходе регрессионного анализа была выявлена наибольшая корреляционная зависимость между содержанием нейронов в области базальных ганглиев и двигательной активностью у 2-месячных крыс для каждого пола. Эти показатели заметно связаны и у 7-месячных животных, в то время как у 16-месячных особей наличие подобной связи прослеживается в меньшей мере и имеет U-образный вид (рис. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные нами данные иллюстрируют динамику изменения степени влияния морфологических и количественных характеристик стриатума на поведение животных в зависимости от возраста и пола соответствующей группы [10–13].

Базальные ганглии головного мозга представляют собой молекулярно и функционально неоднородные подкорковые структуры, участвующие в осуществлении моторных функций, принятии решений, обучении, формировании мотивации, поведения и памяти [10][14].

Стриатум – первичное входное ядро базальных ганглиев, в основном состоит из гамма-аминомасляная кислота-ергических (ГАМКергических) проекционных нейронов, называемых средними шиповатыми нейронами. Они разделены на две популяции с отдельными выходными проекционными путями, которые противоположно модулируют выходные структуры базальных ганглиев. В полосатом теле также присутствуют небольшие популяции интернейронов, в том числе холинергические интернейроны [15][16].

Стриатум получает входные данные от коры головного мозга и таламуса и отправляет выходные данные через таламус по ассоциативным и проекционным связям обратно к коре и нижележащим структурам. В области полосатого тела глутаматергический вход многих областей мозга сливается с импульсацией дофаминовых нейронов среднего мозга, что обуславливает жизненно важную роль стриатума в обучении и принятии решений [17].

Моторная кора – ключевая структура лобных отделов головного мозга, ответственная за обучение двигательным навыкам, обеспечивающая произвольную моторную активность, планирование двигательных актов и мышечную память [18–20]. Осуществление специфических функций моторной коры обусловлено ее значительной пластичностью, а также существованием тесных связей с другими областями мозга [21][22]. В частности, изучение морфолого-анатомических соединений моторной коры выявило наличие нейронной сети, связывающей моторную, премоторную кору, сенсорные области неокортекса и базальные ганглии головного мозга крыс [23][24] Именно взаимоотношениям коры и базальных ганглиев в обеспечении двигательных актов и посвящены многие из рассматриваемых работ.

Базальные ганглии тесно связаны с неокортексом (в частности, с моторной корой) через олигосинаптические петли. Сигнальные пути этих петель преимущественно сходятся в моторных областях лобной коры и в основном разделены на подкорковом уровне, что дает основание предполагать наличие функциональной взаимосвязи стриатума и моторной коры при обеспечении моторных функций [24].

Влиянию моторной коры и стриатума на моторную функцию и поведение крыс посвящено множество работ, включающих, помимо указания роли отдельных структур в регуляции активности [25][26], механизм взаимосвязи этих отделов головного мозга друг с другом. Считается, что базальные ганглии (BG – basal ganglia) совместно с другими подкорковыми структурами (так называемый BGsubcortical pathway) ответственны за выполнение стереотипных движений и врожденных форм поведения у крыс [19]. В последнее время значительно расширяются представления о роли стриатума в регуляции поведения. Так, например, доказано влияние базальных ганглиев в формировании двигательных актов крыс путем обучения методом проб и ошибок [11][19]. Что касается приобретенных двигательных навыков, то их формирование и осуществление находится под контролем моторной коры, которая осуществляет свою систему управления через таламус (за счет таламокортикальных связей) [27–29]. Имеются также данные о вовлеченности стриатума в развитие различных моторных нарушений, связанных с болезнью Паркинсона [30][31].

Многие исследователи пытаются выявить корреляционную зависимость количества нейронов в моторной коре и стриатуме с двигательной активностью у крыс разных возрастных групп. В ранее проведенном нами исследовании отмечено наличие структурно-функциональных связей между моторной корой и двигательной активностью, которая, однако, выражена в большей степени у взрослых животных. В это же время у молодых животных, сопоставив данные с полученными в настоящей работе, можно предположить наибольшую роль стриатума в обеспечении двигательного поведения [32]. Большинство статей посвящены изучению крыс с рождения и до подросткового периода, так как в этом временном интервале наблюдаются наибольшие изменения их поведения. Согласно Mengler et al. головной мозг крыс подвергается сильному росту в течение первых месяцев после рождения [33]. Это подтверждается статистической оценкой с построением кривой роста. При этом после 2 месяцев постнатального развития объем головного мозга существенно не меняется. Анализируя объемные графики коры и базальных ганглиев, приводимые в исследовании, мы можем заключить, что они показывают значительное увеличение от 3-недельного возраста до 1 месяца, непрерывный рост от 1 месяца до 2 месяцев и отсутствие существенных изменений от 2 месяцев до 3 месяцев. В стриатуме временная шкала развития, наблюдаемая при DWI (диффузновзвешенном изображении), по-видимому, согласуется с процессом миелинизации, визуализируемым при гистологическом исследовании, идентифицируя пучки волокон на срезах нервной ткани, окрашенной крезиловым фиолетовым и BGII [33]. Несмотря на активное применение иммуногистохимических методов выявления различных структур в нервной системе, классическая нейроморфология остается актуальным подходом для изучения структур центральной нервной системы [34].

Большинство исследователей сходятся во мнении, что кора и базальные ганглии в течение постнатального развития крысы находятся во взаимосвязи и определяют преобладание тех или иных форм поведения в разные возрастные периоды [23][33]. Моторная кора головного мозга крысы находится под влиянием не только периферических сенсорных афферентов и префронтальных ассоциативных областей, но и базальных ганглиев. Оценка уровня этих восходящих влияний на кору со стороны базальных ганглиев производится благодаря следующим тестам в разных возрастных группах: двигательные тесты на равновесие, навигацию по лабиринту, подъем по пандусу, а также исследование полового поведения крыс (в период полового созревания в возрасте 6–7 месяцев) [35].

Согласно результатам исследования регуляция двигательной активности, осуществляемая многими участками головного мозга, в большей степени коррелирует у молодых животных (2-мес.) с количеством нейронов в подкорковых структурах (стриатум). Вместе с тем в ходе онтогенеза наблюдается возрастание корреляционной зависимости между локомоторной деятельностью и количеством нейронов в структурах коры головного мозга [18][20][21][24]. Это подтверждает ранее полученные нами данные о роли моторной коры в обеспечении двигательного поведения у крыс в онтогенезе с учетом половых различий [32].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Количество нейронов в стриатуме подвержено половой и возрастной динамике, в то время как их размер остается неизменным в течение изучаемого нами периода. Для животных обоего пола отмечено снижение роли стриатума в обеспечении двигательной активности в процессе взросления. Эта связь максимальна у 2-месячных крыс, незначительно снижается к 7 месяцам, в дальнейшем еще более ослабевая к 16 месяцам жизни.

Описанная закономерность может быть обусловлена сложными морфофункциональными процессами реорганизации коры, наблюдаемыми у молодых особей в антенатальном онтогенезе. В результате происходящих в первый месяц постнатальной жизни перестроек структур головного мозга главенствующая роль в регуляции поведения в целом и моторной активности в частности, приходившаяся на подкорковые структуры головного мозга, перераспределяется в направлении регуляции локомоторного поведения корковыми структурами.