Цитокиновый профиль зубодесневой жидкости у детей с нарушением системы иммунологического надзора

Список сокращений:

• GBI – gingival bleeding index, индекс кровоточивости десны
• GI – gingival index score, десневой индекс
• IL-10 – interleukin-10, интерлейкин 10
• IL-1RA – interleukin-1 receptor antagonist, антагонист рецептора интерлейкина 1
• IL-1β – interleukin-1β, интерлейкин 1 бета
• IL-18 – interleukin-18, интерлейкин 18
• MCP-1 – monocyte chemoattractant protein-1, моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1
• OHI-S – oral hygiene indices – simplified, упрощенный индекс гигиены полости рта
• VEGF – vascular endothelial growth factor, васкулоэндотелиальный фактор роста
• ГИБТ – генно-инженерная биологическая терапия
• ЗДЖ – зубодесневая жидкость / GCF – gingival crevicular fluid
• КПУ – кариес, пломба, удаленный зуб / DMF – decayed, missing, filled index
• НПВП – нестероидные противовоспалительные препараты
• РА – ревматоидный артрит
• ЮРА – ювенильный ревматоидный артрит

Современные исследования свойств и молекулярного состава зубодесневой жидкости (ЗДЖ) при воспалительных заболеваниях пародонта позволили сформулировать цитокиновую концепцию развития этого патологического процесса [1–3]. В рамках данной концепции установлено, что пародонто-патогенные бактерии индуцируют усиление продукции провоспалительных цитокинов активированными моноцитами и макрофагами, что приводит к дисбалансу между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами. Исходом каскадных межклеточных взаимодействий, регулируемых цитокинами, является активация остеокластов и резорбция костной ткани [4]. Установлено, что активация иммунного ответа на Th1-тип реагирования и снижение функцио­нальной активности B-лимфоцитов обуславливают увеличение концентрации провоспалительных цитокинов в ЗДЖ [5].

Цитокины представляют собой малые белковые молекулы, которые секретируются различными клетками системы иммунологического надзора [6]. Они осуществляют коммуникацию между клетками, стимулируют их деление, функциональную активность и апоптоз [7]. Цитокины играют ведущую в роль в координации работы врожденного и адаптивного иммунитета. Количество и тип цитокинов, секретируемых клетками, различаются в зависимости от типа патогена, что способствует адаптации иммунной системы к ответу и определяет, будет ли он врожденным или адаптивным.

Если имеет место сбалансированность между местной стимуляцией и умеренным иммунным ответом, то доминирует иммунологический надзор и соответствующий иммунный ответ [8]. При повышении уровня колонизации ключевыми пародонтогенными бактериями происходит чрезмерная активация иммунного ответа и разрушение тканей [9].

К основным цитокинам, участвующим в воспалительной реакции и воздействующим на костную ткань, относят IL-1β (interleukin-1β, интерлейкин 1 бета). Другим важным цитокином, участвующим в развитии иммунопатологического процесса, является IL-18 (interleukin-18, интерлейкин 18), который регулирует Т-хелперный тип иммунной реакции, усиливает синтез других провоспалительных цитокинов [10], в частности MCP-1 (мonocyte chemoattractant protein-1, моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1), который регулирует процесс миграции и инфильтрации макрофагов и моноцитов [11].

К противовоспалительным цитокинам относятся: IL-1RA (interleukin-1 receptor antagonist, антагонист рецептора интерлейкина 1), блокирующий взаимодействие IL-1β с клеточным рецептором и препятствующий реализации его эффектов; IL-10 (interleukin-10, интерлейкин 10) – ингибитор провоспалительного цитокинового каскада, играющий ведущую роль в противовоспалительной реакции [12]. Ведущее значение в воспалительной иммунной реакции имеет VEGF (vascular endothelial growth factor, васкулоэндотелиальный фактор роста), который является многофункциональным ангиогенным цитокином [13][14].

Следовательно, изучение механизмов и каскадов реакций в тканях пародонта при воспалении считается перспективным с точки зрения разработки новых методов и подходов к лечению гингивитов и пародонтитов [15].

Разрушение тканей, сопровождающее многие хронические аутоиммунные воспалительные заболевания у детей, такие как ювенильный ревматоидный артрит (ЮРА), воспалительные заболевания кишечника, анкилозирующий спондилоартрит, псориаз и астма, также регулируется иммунным ответом хозяина. Общность каскада воспалительных реакций при соматических заболеваниях и при воспалительном процессе в тканях пародонта обусловлена появлением аутоантигенных свойств у клеток и нарушением баланса цитокиновой регуляции иммунологических процессов [16]. При этом воспалительный процесс в тканях пародонта становится хроническим как следствие нарушения баланса провоспалительных и противовоспалительных цитокинов.

В связи с этим одним из перспективных направлений разработки персонализированного плана лечения служит изучение патогенетических механизмов заболеваний тканей пародонта у детей с нарушением системы иммунологического надзора. Цель представленного исследования: изучить цитокиновый профиль ЗДЖ у детей с ЮРА.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проведено пилотное одномоментное одноцентровое исследование по определению содержания прои противовоспалительных цитокинов и хемокинов в ЗДЖ у детей с ЮРА. Исследование одобрено локальным комитетом по этике (протокол № 4 от 15.04.2010).

Клинический этап исследования выполнялся на базе Университетской детской клинической больницы ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет) с 1 марта по 30 апреля 2022 года. Нормативной базой для его выполнения был Федеральный закон от 21 ноября 2011 г. № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2011, № 48, ст. 6724)¹.

Производился сплошной набор пациентов. Всего обследовано 30 детей с ЮРА в возрасте от 6 до 15 лет, проходивших лечение в ревматологическом отделении. У всех пациентов диагноз «Ювенильный ревматоидный артрит» (код по международной классификации болезней 10-го пересмотра: M08.0) был установлен на основе клинико-лабораторных данных.

Критериями невключения в исследование были: наличие острого воспалительного заболевания (2 пациента), текущее ортодонтическое лечение (4 пациента); критерий исключения: решение родителей/ представителей ребенка прекратить участие в исследовании на любом из его этапов (4 пациента). Таким образом, в итоговый анализ включены 20 пациентов с ЮРА, из них на момент исследования низкая активность заболевания отмечена у 5 (25%), средняя активность – у 12 (60%), высокая – у 3 (15%) детей. Большая часть пациентов – 14 (70%) в качестве базисной терапии получала генно-инженерную биологическую терапию (ГИБТ), все пациенты получали нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП).

В контрольную группу были включены 10 пациентов в возрасте от 9 до 16 лет, не имевших ЮРА и проходивших стоматологическое обследование на кафедре детской, профилактической стоматологии и ортодонтии Института стоматологии имени Е.В. Боровского ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет) в сроки набора группы исследования. Критериями невключения были: ортодонтическое лечение, местные или системные острые/ хронические заболевания.

Обязательным условием включения детей в группу исследования и контроля было наличие подписанного информированного согласия родителем или официальным представителем ребенка.

Стоматологическое обследование детей проводили по стандартной схеме, включающей данные анамнеза, объективного внешнего и внутриротового обследования. Индекс интенсивности кариеса определялся суммой постоянных зубов с кариозными полостями, пломбами и числом удаленных зубов (индекс КПУ). При значениях КПУ 0–1,1 уровень интенсивности кариеса определялся как очень низкий, 1,2–2,6 – низкий, 2,7–4,4 – средний, 4,5–6,5 – высокий и 6,6 и выше – очень высокий.

Упрощенный индекс оценки гигиены – OHI-S (Oral Hygien Indices – Simplified) по методу J.C Green, J.K. Vermillion определяли, окрашивая 6 индексных зубов. Уровень гигиены по индексу OHI-S оценивали по следующим критериям: 0–0,6 балла – хороший уровень гигиены, 0,7–1,8 – удовлетворительный, 1,9–2,5 – неудовлетворительный, более 2,6 – плохой.

Десневой индекс GI (gingival index) по Н. Silness и J. Loe, который позволяет определить локализацию и тяжесть течения гингивита, определяли с помощью зондирования десны в области индексных зубов пародонтальным зондом. Степень тяжести гингивита определяли по критериям: 0,1–1,0 балла – легкая, 1,1–2,0 – средняя, 2,1–3,0 – тяжелая степень. Выраженность кровоточивости десны оценивали по индексу кровоточивости десен GBI ( Gingival Bleeding Index) по J. Ainamo и I. Bay. Если кровотечение происходило в течение 10 секунд, регистрировался положительный результат и записывалось количество положительных участков, которое затем выражалось в процентах от количества обследованных участков.

Для забора ЗДЖ использовали общепринятый метод: изначально участок десны очищали от налета и высушивали с помощью стерильных ватных валиков. Получение жидкости из зубодесневой борозды проводили с помощью специальных бумажных абсорбирующих эндодонтических штифтов (Absorbent Paper Points, размер 25, President Dental, Германия), которые удобны для погружения в зубодесневую борозду. Материал данных штифтов представляет собой бумагу, обладающую высокой абсорбирующей способностью и не содержащую примеси. С помощью пинцета штифты погружали в зубодесневую борозду центрального правого резца в течение 1–2 минут для пропитывания ЗДЖ, далее штифт погружали в пробирку типа Eppendorff (Eppendorf Austria GmbH), содержащую 1 мл раствора хлорида натрия с 0,2% биоцида ProClin серии 300. Пробирки встряхивали с помощью центрифуги-вортекс СМ 70М-07 (ELMI, Латвия) в течение 10 минут. В результате получали образцы ЗДЖ с разведением 1:100. Их замораживали при -80 °С и хранили до проведения анализа.

В образцах ЗДЖ с помощью набора реагентов для иммуноферментного анализа ООО «ВекторБест» (Российская Федерация, Новосибирск) определяли концентрацию IL-18, IL-10, IL-1β, IL-1RA, MCP-1, VEGF.

Статистическая обработка данных

Данные представлены как абсолютное число пациентов и процент от общей численности группы. Для определения нормальности распределения непрерывных данных в группах использовали тест Шапиро – Уилка. Для признаков с нормальным распределением переменных данные представлены в виде среднего и стандартного отклонения, при сравнении групп использовался t-критерий Стьюдента. Признаки с ненормальным распределением представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25-й; 75-й процентили), при сравнении таких признаков между группами использовали непараметрический критерий Уилкоксона. В качестве порогового значения принят уровень значимости р < 0,05. Статистическая обработка данных производилась с помощью статистических пакетов: IBM SPSS Statistics 21.0 (IBM Corporation, США) и MedCalc v.16.8.4. (MedCalc Software Ltd, Бельгия).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристики групп по гигиеническому состоянию полости рта

Группа детей с ЮРА была сопоставима по возрасту и полу с контрольной группой.

Были выявлены существенные различия в стоматологическом статусе детей. Так, у детей с ЮРА индекс КПУ был выше, чем аналогичный показатель в контроле. Удовлетворительная или хорошая гигиена полости рта отмечена у 55% пациентов в группе ЮРА и 90% в контроле. Эти данные подтверждены индексной оценкой OHI-S: установлено повышение данного индекса в группе пациентов с ЮРА (табл. 1).

Состояние тканей пародонта, оцениваемое по пародонтальным индексам, выявило, что значение индексов GI и GBI в группе пациентов с ЮРА было статистически значимо выше, чем в группе контроля (табл. 1). Средняя и тяжелая степень гингивита отмечена у 90% детей с ЮРА, в группе контроля только у 20% детей выявлена средняя степень гингивита, у остальных – легкая.

Концентрация цитокинов в зубодесневой жидкости

Анализ содержания провоспалительных цитокинов в ЗДЖ показал более низкое содержание IL-18 – 6,70 (4,97–7,92) пг/мл в группе ЮРА по сравнению с контролем – 11,25 (8,70–13,10) пг/мл (р < 0,05). Концентрация IL-1β была повышена – 15,30 (13,79–17,18) пг/мл в группе пациентов с ЮРА по сравнению с контрольной 5,36 (5,32–5,54) пг/мл (р < 0,05) (рис. 2А, В).

При анализе содержания противовоспалительных цитокинов были получены следующие данные: содержание IL-10 в группе ЮРА 3,60 (2,89–4,45) пг/мл, в контрольной группе – 1,90 (1,54–3,10) пг/мл (различия статистически не значимы). Концентрация другого противовоспалительного цитокина, IL-1RA, была ниже в группе пациентов с ЮРА, чем в контроле: 3638,5 (2397,5–4133,5) и 4951,0 (4303,0–5455,0) пг/мл соответственно (р < 0,05). (рис. 2C, D).

Содержание МСР-1 в ЗДЖ не имело значимых различий в группах: 15,65 (14,15–17,39) и 15,50 (12,80–21,20) пг/мл соответственно. Одновременно с этим концентрация VEGF в группе ЮРА была в несколько раз выше по сравнению с контролем: 49,60 (41,95–54,50) и 12,00 (11,00–13,00) пг/мл соответственно (р < 0,05) (рис. 2E, F).

ОБСУЖДЕНИЕ

В нашем исследовании отмечена тенденция к увеличению тяжести заболеваний пародонта у детей с ЮРА: у 18 (90%) пациентов выявлен гингивит средней или тяжелой степени, отмечено повышение индекса GI и GBI, что согласуется с данными ряда авторов [17][18].

В ЗДЖ пациентов с ЮРА установлен дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов. Так, уровень провоспалительного IL-18 был ниже, в то время как содержание IL-1β выше, чем в контроле. Следует отметить, что концентрация MCP-1 в исследуемой группе не отличалась от контрольной. Одновременно отмечено снижение содержания противовоспалительного IL-1RA в ЗДЖ пациентов с ЮРА, тогда как содержание IL-10 имело тенденцию к повышению по сравнению с контрольной группой. Концентрация VEGF в ЗДЖ была статистически значимо выше у пациентов с ЮРА.

Причины и механизмы прогрессирования гингивита при ЮРА до настоящего времени до конца не установлены. Содержание провоспалительных цитокинов и хемокинов, таких как IL-18 и MCP-1, в ЗДЖ значимо не отличалось от данных контрольной группы, что, возможно, связано с терапией основного заболевания – с применением НПВП и ГИБТ, непосредственно подавляющих продукцию ряда основных провоспалительных цитокинов. Некоторые авторы считают, что НПВП снижают активность иммунных клеток, поэтому при прекращении их фармакологического действия иммунные клетки повторно активируются [19]. M. Hatipoğlu и соавт. [20] установили, что у взрослых пациентов, принимающих анти-B-клеточную терапию, понижается уровень IL-1β в ЗДЖ, что позволяет предположить, что лечение ревматоидного артрита (РА) может изменять биохимические параметры ЗДЖ. Такие же выводы приводятся B. Cetinkaya и соавт. [21] при изучении концентрации в ЗДЖ таких цитокинов, как IL-1β, IL-4, IL-10и TNF-α (tumor necrosis factor-α, фактор некроза опухоли альфа): иммунологическая оценка не выявила статистически значимых различий в уровнях провоспалительных и противовоспалительных цитокинов между пациентами с РА и контролем. При этом в ряде других исследований было обнаружено, что концентрации IL-1β, IL-4, IL-10, матриксной металлопротеиназы-8, -13 и TNF-α в ЗДЖ были выше у пациентов с РА, чем в контроле. Так, B. Acar и соавт. [22] выявили повышенный уровень противоспалительного цитокина IL-10 на фоне ГПБТ пациентов с ЮРА.

Ряд исследователей считает важным определение IL-1β и IL-18 в ЗДЖ, так как их содержание прямо коррелирует с наличием ряда пародонтопатогенных бактерий, таких как F. nucleatum, C. rectus, P. microsи S. intermedius. Так, у детей с ЮРА L.A. Miranda и соавт. [23] были выявлены повышенные уровни IL-1β и IL-18 в сыворотке, что коррелировало с изменением микробиоты в ЗДЖ. Эти же авторы указывают, что начинающаяся потеря прикрепления, наблюдаемая у детей с ЮРА, может быть связана с измененной системной воспалительной реакцией [23]. При этом цитокины, продуцируемые клетками организма хозяина, играют важную роль в патогенезе как РА, так и заболеваний тканей пародонта. Так, в исследовании F.Y. Bozkurt [24] у пациентов с сочетанием этих заболеваний уровень IL-10 был значительно выше, чем в контроле. Наши данные согласуются с этим исследованием: отмечена тенденция к повышению IL-10 в группе детей с ЮРА.

При развитии хронического воспаления в тканях пародонта развивается гипоксия, которая активирует секрецию резидентными и воспалительными макрофагами различных цитокинов, регулирующих процесс ангиогенеза (например, VEGF) [13]. Таким образом, повышенный уровень VEGF в ЗДЖ у детей с ЮРА может быть маркером гипоксии в тканях пародонта.

Наше исследование имело ряд ограничений, связанных с небольшим объемом выборки и разной степенью активности заболевания у пациентов с ЮРА.

Выявление цитокиновых маркеров и предикторов воспаления, в том числе и аутовоспаления, в ЗДЖ у детей с нарушениями системы иммунологического надзора (например, при ЮРА) является перспективным направлением научных исследований, таким, как и исследование влияния цитокинов на культуральные макрофаги ротовой жидкости, изучение взаимосвязи микробиоты полости рта с изменениями уровня цитокинов ЗДЖ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в развитии гингивита у детей с ЮРА играет роль дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов. Установлено повышенное содержание в ЗДЖ IL-1β, который является триггером всех провоспалительных цепочек, снижение IL-1RA – противовоспалительного цитокина, повышение VEGF – маркера гипоксии. Изучение цитокинового профиля ЗДЖ уточняет механизмы развития иммуновоспалительной реакции в тканях пародонта, требует дальнейшего изучения и перспективно в выборе персонализированного подхода к терапии.

ВКЛАД АВТОРОВ

О.Л. Морозова и О.И. Адмакин разработали основную концепцию и дизайн исследования, а также проводили редактуру статьи. Ю.А. Козлитина и Н.Б. Захарова выполняли экспериментальную часть, отбирали и анализировали биоматериал, осуществляли лабораторные исследования. Н.С. Морозова интерпретировала полученные лабораторные данные, а также написала основную часть финальной версии статьи. Все авторы утвердили окончательную версию публикации.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

Olga L. Morozova and Oleg I. Admakin developed the basic concept and design of the study, edited the article. Iuliia A. Kozlitina and Natalia B. Zakharova performed the experimental part, collected and analyzed the biomaterial, carried out laboratory studies. Natalia S. Morozova interpreted the obtained laboratory data and also wrote the main part of the final version of the article. All authors have approved the final version of the publication