Возрастное развитие соматостатинергических нейронов симпатических превертебральных узлов

Список сокращений:

• CY3 – indocarbocyanine, индокарбоцианин
• FITC – fluorescein isothiocyanate, флуоресцеин-изотиоцианат
• IR – immunoreactive, иммунореактивные
• NPY – neuropeptide Y, нейропептид Y
• PBS – phosphate buffered saline, фоcфатно-cолевой буфеp
• SST – somatostatin, соматостатин
• SSTR – somatostatin receptor, рецепторк соматостатину
• TH – tyrosine hydroxylase, тирозингидроксилаза
• КБГ– краниальный брыжеечный ганглий
• КШГ – краниальный шейный ганглий
• ЧГ – чревный ганглий

Соматостатин (somatostatin, SST) представляет собой полипептид, относящийся к гормонам и нейропептидам. Существует в двух биологически активных формах: SST-14 и SST-28, которые различаются, соответственно, числом входящих в состав молекулы аминокислот [1]. Физиологические функции опосредованы 5 типами рецепторов к соматостатину: SSTR1–SSTR5 (somatostatin receptor), которые имеют похожую структуру и механизмы передачи сигналов, но отличаются своей клеточной и субклеточной локализацией и способом регуляции [1][2].

SST прежде всего рассматривается как сильный ингибирующий фактор в эндокринной системе и желудочно-кишечном тракте; влияет на деление клеток, сократимость гладких мышц внутренних органов, обмен питательными веществами. В качестве нейропептида SST оказывает прямое действие на центральную нервную систему и передачу нервных импульсов [1][3]; также играет роль трофического фактора в развитии нейронов в эмбриогенезе [4]. В недавних исследованиях обнаружено присутствие SST в автономной нервной системе млекопитающих – в части нейронов симпатических узлов [5]. В подавляющем большинстве этих нейронов содержится медиатор норадреналин и фермент его синтеза тирозингидроксилаза (tyrosine hydroxylase, TH), две трети нейронов содержат нейропептид Y (neuropeptide Y, NPY) [6][7].

Нейромедиаторный состав симпатических нейронов изменяется в онтогенезе, а также различен по локализации в ганглиях [8–10]. В частности, у крысы в эмбриогенезе на 16 сутки эмбрионального развития наблюдается транзиторная экспрессия SST в большинстве симпатических ганглионарных нейронов [10][11].

Во время эмбрионального развития морской свинки в солнечном сплетении SST-иммунореактивные (immunoreactive, IR) нейроны появляются позже, чем NPY-IR, причем большинство (75%) SST-IR нейронов на поздних эмбриональных стадиях продолжают экспрессировать NPY, что в неонатальном периоде наблюдается редко (<2%) [8][12].

После рождения у мыши в превертебральных узлах выявляется малое число SST-IR нейронов [13]. тогда как у морской свинки их количество в превертебральных узлах солнечного сплетения достигает 25%, а у свиней 12–15%, в отличие от паравертебральных узлов [14][15]. Так, в паравертебральном звездчатом ганглии крысы самая высокая доля нейронов, содержащих SST, наблюдается у новорожденных (7% от общего числа нейронов), позже количество SST-IR нейронов снижается до 4% и остается постоянным, начиная с 10 дней жизни [9].

В литературных источниках отсутствуют данные о постнатальных изменениях состава нейромедиаторов в других симпатических узлах, в частности паравертебральном краниальном шейном ганглии (КШГ), а также в солнечном сплетении: превертебральных чревных ганглиях (ЧГ) и краниальном брыжеечном ганглии (КБГ).

Целью исследования является определение содержания SST-IR нейронов в КШГ и солнечном сплетении крысы в постнатальном онтогенезе, а также колокализации соматостатина с другими нейротрансмиттерами, включая фермент синтеза катехоламинов TH и NPY.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на 30 белых крысах-самцах линии Wistar следующих шести возрастных групп (по 5 крыс в каждой): новорожденные, 10-, 20-, 30-, 60-суточные, 24-месячные.

Животных выводили из эксперимента путем инъекции летальной дозы уретана (3 г/кг, внутрибрюшинно). Далее проводилась транскардиальная перфузия раствором стандартного фоcфатно-cолевого буфеpа (phosphate buffered saline, PBS) 0,01 М, pH 7,4 (ООО «БиолоТ», РФ) объемом от 20 до 500 мл в зависимости от возраста, а затем таким же объемом фиксирующей смеси 4% pаcтвоpа паpафоpмальдегида (Sigma, США) в PBS. Далее извлекались: КШГ, ганглии солнечного сплетения (правый и левый ЧГ и КБГ) и помещались на 2 часа при комнатной температуре в ту же фиксирующую смесь, в которой проводили перфузию. Затем ганглии три раза промывались в PBS по 10 минут с интервалом в 5 минут и перемещались в 30% раствор сахарозы на PBS на 12 часов при температуре 4 °С. Серии срезов толщиной 12 мкм изготовляли на криостате.

На следующем этапе проводили прединкубацию срезов в течение 30 мин при комнатной температуре в PBS с добавлением 10% ослиной сыворотки (Jackson Immunoresearch, США), 1% тритона X-100, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% тимерозола. После этого срезы инкубировали с первичными антителами: козьими против SST, 1:200 (Santa Cruz, sc-7819), овечьими против TH, 1:1000 (Abcam, ab113), кроличьими против NPY, 1:500 (Abcam, ab30914), в течение 24 ч при комнатной температуре. После кратковременной промывки в PBS срезы инкубировали со вторичными антителами в течение 2 ч. Вторичные антитела были конъюгированы с флуорохромами – флуоресцеин изотиоцианатом (fluorescein isothiocyanate, FITC), дающим зеленую флуоресценцию, и индокарбоцианином (indocarbocyanine, CY3), дающим красную флуоресценцию (разведение 1:150, Jackson Immunoresearch, США).

Окраску клеток всей популяции нейронов проводили зеленым флуоресцентным красителем NeuroTrace™ Green Fluorescent Nissl Stains (Molecular Probes, США) – разведение 1:200. После этого срезы отмывали в PBS и заключали в среду для флуоресцентной микроскопии VectaShield (Vector Laboratories, США). Для исключения неспецифической реакции часть срезов инкубировали без первичных и/или вторичных антител.

Анализ препаратов проводился с использованием программно-аппаратного комплекса, включающего флуоресцентный микроскоп Olympus BX43 (Olympus, Япония) с набором фильтров (модуль зеркал UFBWA – синее возбуждение, фильтр возбуждения BP460-495, барьерный фильтр BA510550 – зеленая флуоресценция; модуль зеркал U-FGWА – зеленое возбуждение, фильтр возбуждения BP530-550, барьерный фильтр BA575-625 – красная флуоресценция), охлаждаемую ССD камеру Tucsen FL-20 (Xintu Photonics, Китай) и компьютер на базе процессора Intel Core i7 (Intel, США). Получение и последующая обработка изображений проводилась с использованием программы Mosaic, версия 2.1 (Xintu Photonics, Китай).

Полученные мультиканальной флуоресценцией с различными спектрами флуорохромов изображения препаратов комбинировали при помощи программы Paint Shop Pro 7.02 (Jasc Software, Inc., США), при этом накладывали снимки одного и того же поля зрения. Объединенный рисунок отображал зеленый и красный цвета и зоны их перекрытия в виде градиента желто-зеленого цвета.

Для выявления меченых нейронов использовали каждый третий из серийных срезов. Число меченых нейронов определяли на изображениях срезов площадью 0,14 мм², полученных под объективом 20х/0,50. Долю SST-IR нейронов определяли как их отношение к общему количеству нейронов, выявленных с помощью NeuroTrace™ Fluorescent NisslStains, которое принимали за 100%. Анализу подлежали нейроны, срез которых прошел через ядро с видимым ядрышком и с флуоресценцией, превышающей фоновое свечение. Число меченых нейронов, а также среднюю площадь сечения SST-IR нейронов определяли с помощью программы Image J (NIH, США). Для определения средней площади сечения при увеличении 200 вручную обводили границы IR клеток. Всего для анализа брали 200 нейронов в каждом ганглии каждой возрастной группы.

Статистическая обработка данных

Проверка на нормальность распределения случайных величин проводилась с использованием критерия Шапиро – Уилка. Значимость различий средних величин оценивалась при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для парных сравнений использовался t-критерий Стьюдента, для множественных межгрупповых сравнений использовалась поправка Бонферрони. Различия принимались как значимые при р < 0,05. Для статистического анализа данных использовалась программа Sigma Plot (Systat Software, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты показали, что иммуномечение к SST и NPY было представлено в виде гранул, заполняющих цитоплазму, в то время как иммунореактивность к TH была относительно гомогенной. В большинстве нейронов иммунореактивный материал обнаруживался в области тел, тем не менее у отдельных клеток он выявлялся и в области проксимальных дендритов.

Меченые нейроны были распределены по поверхности среза относительно равномерно. Мы не обнаружили количественных различий между левым и правым ЧГ, поэтому далее представлены усредненные данные по обоим узлам.

SST-IR нейроны не обнаруживались в КШГ, но выявлялись в солнечном сплетении. Начиная с периода новорожденности и до 24 мес. часть нейронов и в ЧГ, и в КБГ была SST-IR (рис. 1).

У новорожденных треть нейронов в ЧГ и КБГ была с IR. Доля SST-IR нейронов удваивалась в онтогенезе в обоих узлах в течение первых 30 суток жизни и сохранялась на уровне 70–73% до 24 мес. (табл. 1). Мы не наблюдали значимых различий по долям SST-IR между КБГ и ЧГ в каждой из возрастных групп.

Средняя площадь сечения SST-IR нейронов увеличивалась в ЧГ и КБГ с момента рождения до 60 суток жизни (табл. 2). С 20-х суток жизни у крыс средняя площадь сечения SST-IR нейронов в ЧГ была статистически значимо выше, чем в КБГ.

Во всех возрастных группах, с момента рождения и до 24 мес., все SST-IR нейроны ЧГ и КБГ колокализовали фермент синтеза катехоламинов TH. При этом, независимо от возраста, подавляющее большинство SST-IR нейронов (90–94%) содержали NPY (рис. 1, 2). Не было обнаружено значимых различий между долями SST-IR нейронов, колокализующих NPY, в различных возрастных группах (рис. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты настоящего исследования демонстрируют наличие SST-IR нейронов в превертебральных ЧГ и КБГ к моменту рождения, при этом в паравертебральном КШГ SST-IR нейроны не обнаружены. Доля SST-IR нейронов в превертебральных узлах у крысы превосходит аналогичный показатель у других млекопитающих, включая мышь, морскую свинку, свинью и человека: у мыши и человека обнаруживались лишь отдельные SST-IR нейроны, а у свиней и морской свинки количество SST-IR нейронов в превертебральных узлах доходит до 12–15 и 25% соответственно [5][6][13][14].

Наши более ранние данные свидетельствуют о том, что у крысы в узлах солнечного сплетения содержится больше SST-IR нейронов по сравнению с другими узлами, включая звездчатый узел [9]. Мы впервые обнаружили, что в онтогенезе крысы в первые 30 суток жизни доля SST-IR нейронов увеличивается в превертебральных симпатических узлах, в частности ЧГ и КБГ. В отличие от этого в паравертебральном звездчатом ганглии крыс наибольшее количество нейронов, содержащих SST, обнаруживалось у новорожденных животных и составляло 7% [9] В постнатальном онтогенезе в данном узле доля SST-IR нейронов уменьшается в первые 10 суток жизни до 4% [9]. Таким образом, в различных симпатических узлах доля SST-IR нейронов изменяется гетерохронно, что может быть связано с особенностями иннервируемых органов-мишеней. КШГ обеспечивает симпатическую иннервацию головы, звездчатый ганглий – органов грудной полости и шеи, а превертебральные узлы – органов брюшной полости [16][17]. Ранее нами было показано, что SST-IR нейроны, иннервирующие сердце, выявляются в звездчатом узле только у новорожденных крыс и не наблюдаются у более взрослых [18].

В данной работе мы установили, что доля SST-IR нейронов в превертебральных симпатических узлах крысы начиная с возраста 30 суток далее не изменяется до 2 лет. Согласно литературным данным, в гипоталамусе доля SST-IR нейронов у возрастных особей (2–2,5 года) этого вида животных также оставалась постоянной [19].

Продемонстрированная в данной работе более высокая средняя площадь сечения SST-IR нейронов в ЧГ по сравнению с КБГ у 20-суточных и более взрослых крыс подтверждает обнаруженные ранее данные о больших размерах NPY-IR нейронов в ЧГ относительно КБГ [8]. Нами установлено, что практически все SST-IR нейроны превертебральных узлов крыс в различные возрастные периоды также содержат TH и NPY. Нейромедиаторы SST и NPY подавляют перистальтику и секрецию в желудочно-кишечном тракте [7]. Предполагается, что NPY-IR нейроны солнечного сплетения, не содержащие SST, являются вазомоторными, а NPY/SST-IR – висцеромоторными [20]. Наибольшее число висцеромоторных волокон направляется к интрамуральным узлам межмышечного сплетения желудочно-кишечного тракта [7].

Экспрессия SST может изменяться при патологии – например, у свиньи при воспалении желудочно-кишечного тракта, включая язвенный колит и химически индуцированное воспаление нисходящей ободочной кишки, увеличивается количество данного пептида в ганглионарных нейронах [21]. Имеются данные о том, что SST подавляет воспалительные реакции в кишечнике путем двунаправленной коммуникации между нейронами и тучными клетками, также модулирует активность лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником [22]. SST стимулирует пролиферацию B-лимфобластов, при этом ингибирует активность Т-лимфоцитов, пролиферацию гранулоцитов, синтез провоспалительных цитокинов [23]. SST также участвует в соматостатинергической противовоспалительной петле (somatostatinergic anti-inflammatory loop) [24]: когда повреждающие агенты раздражают пептидергические нейроны, это вызывает высвобождение вещества P и/или кальцитонин-ген-родственного пептида (calcitonin gene-related peptide, CGRP). Последние индуцируют локальное нейрогенное воспаление, которое, в свою очередь, вызывает выброс SST из тех же нейронов. SST замыкает круг, останавливая высвобождение вышеуказанных нейропептидов, и ингибирует воспалительные процессы [24].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В раннем постнатальном онтогенезе крысы в превертебральных узлах наблюдается увеличение доли нейронов, содержащих SST, что важно для становления симпатической иннервации желудочно-кишечного тракта. SST не только тормозит моторику и секрецию, но и оказывает обезболивающее и противовоспалительное действие в органах пищеварения. Дальнейшие эксперименты с изучением в различные возрастные периоды состава SST-рецепторов в органах-мишенях позволят уточнить особенности симпатической регуляции пищеварительной системы и разработать возможные пути фармакологической коррекции заболеваний желудочно-кишечного тракта.

ВКЛАД АВТОРОВ

А.И. Емануйлов и В.В. Порсева участвовали в сборе материала, проведении экспериментов и статистической обработке данных. А.В. Павлов и П.М. Маслюков разработали идею и дизайн исследования, а также участвовали в написании рукописи. Все авторы утвердили окончательную версию публикации.

Соответствие принципам этики. Исследование проведено с соблюдением положений Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей. Все манипуляции с животными проведены в соответствии с разрешением Локального этического комитета ФГБОУ ВО «Ярославский государственный медицинский университет» Минздрава России (№ 58-16.05.2022).

Доступ к данным исследования. Данные, подтверждающие выводы этого исследования, можно получить у авторов по обоснованному запросу.

Данные и статистические методы, представленные в статье, прошли статистическое рецензирование редактором журнала – сертифицированным специалистом по биостатистике.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (РНФ), грант 23-25-00141.