Возрастное развитие соматостатинергических нейронов симпатических превертебральных узлов

Список сокращений:

• CY3 – indocarbocyanine, индокарбоцианин
• FITC – fluorescein isothiocyanate, флуоресцеин-изотиоцианат
• IR – immunoreactive, иммунореактивные
• NPY – neuropeptide Y, нейропептид Y
• PBS – phosphate buffered saline, фоcфатно-cолевой буфеp
• SST – somatostatin, соматостатин
• SSTR – somatostatin receptor, рецепторк соматостатину
• TH – tyrosine hydroxylase, тирозингидроксилаза
• КБГ– краниальный брыжеечный ганглий
• КШГ – краниальный шейный ганглий
• ЧГ – чревный ганглий

Соматостатин (somatostatin, SST) представляет собой полипептид, относящийся к гормонам и нейропептидам. Существует в двух биологически активных формах: SST-14 и SST-28, которые различаются, соответственно, числом входящих в состав молекулы аминокислот [1]. Физиологические функции опосредованы 5 типами рецепторов к соматостатину: SSTR1–SSTR5 (somatostatin receptor), которые имеют похожую структуру и механизмы передачи сигналов, но отличаются своей клеточной и субклеточной локализацией и способом регуляции [1][2].

SST прежде всего рассматривается как сильный ингибирующий фактор в эндокринной системе и желудочно-кишечном тракте; влияет на деление клеток, сократимость гладких мышц внутренних органов, обмен питательными веществами. В качестве нейропептида SST оказывает прямое действие на центральную нервную систему и передачу нервных импульсов [1][3]; также играет роль трофического фактора в развитии нейронов в эмбриогенезе [4]. В недавних исследованиях обнаружено присутствие SST в автономной нервной системе млекопитающих – в части нейронов симпатических узлов [5]. В подавляющем большинстве этих нейронов содержится медиатор норадреналин и фермент его синтеза тирозингидроксилаза (tyrosine hydroxylase, TH), две трети нейронов содержат нейропептид Y (neuropeptide Y, NPY) [6][7].

Нейромедиаторный состав симпатических нейронов изменяется в онтогенезе, а также различен по локализации в ганглиях [8–10]. В частности, у крысы в эмбриогенезе на 16 сутки эмбрионального развития наблюдается транзиторная экспрессия SST в большинстве симпатических ганглионарных нейронов [10][11].

Во время эмбрионального развития морской свинки в солнечном сплетении SST-иммунореактивные (immunoreactive, IR) нейроны появляются позже, чем NPY-IR, причем большинство (75%) SST-IR нейронов на поздних эмбриональных стадиях продолжают экспрессировать NPY, что в неонатальном периоде наблюдается редко (<2%) [8][12].

После рождения у мыши в превертебральных узлах выявляется малое число SST-IR нейронов [13]. тогда как у морской свинки их количество в превертебральных узлах солнечного сплетения достигает 25%, а у свиней 12–15%, в отличие от паравертебральных узлов [14][15]. Так, в паравертебральном звездчатом ганглии крысы самая высокая доля нейронов, содержащих SST, наблюдается у новорожденных (7% от общего числа нейронов), позже количество SST-IR нейронов снижается до 4% и остается постоянным, начиная с 10 дней жизни [9].

В литературных источниках отсутствуют данные о постнатальных изменениях состава нейромедиаторов в других симпатических узлах, в частности паравертебральном краниальном шейном ганглии (КШГ), а также в солнечном сплетении: превертебральных чревных ганглиях (ЧГ) и краниальном брыжеечном ганглии (КБГ).

Целью исследования является определение содержания SST-IR нейронов в КШГ и солнечном сплетении крысы в постнатальном онтогенезе, а также колокализации соматостатина с другими нейротрансмиттерами, включая фермент синтеза кате­холаминов TH и NPY.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на 30 белых крысах-самцах линии Wistar следующих шести возрастных групп (по 5 крыс в каждой): новорожденные, 10-, 20-, 30-, 60-суточные, 24-месячные.

Животных выводили из эксперимента путем инъекции летальной дозы уретана (3 г/кг, внутрибрюшинно). Далее проводилась транскардиальная перфузия раствором стандартного фоcфатно-cолевого буфеpа (phosphate buffered saline, PBS) 0,01 М, pH 7,4 (ООО «БиолоТ», РФ) объемом от 20 до 500 мл в зависимости от возраста, а затем таким же объемом фиксирующей смеси 4% pаcтвоpа паpафоpмальдегида (Sigma, США) в PBS. Далее извлекались: КШГ, ганглии солнечного сплетения (правый и левый ЧГ и КБГ) и помещались на 2 часа при комнатной температуре в ту же фиксирующую смесь, в которой проводили перфузию. Затем ганглии три раза промывались в PBS по 10 минут с интервалом в 5 минут и перемещались в 30% раствор сахарозы на PBS на 12 часов при температуре 4 °С. Серии срезов толщиной 12 мкм изготовляли на криостате.

На следующем этапе проводили прединкубацию срезов в течение 30 мин при комнатной температуре в PBS с добавлением 10% ослиной сыворотки (Jackson Immunoresearch, США), 1% тритона X-100, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% тимерозола. После этого срезы инкубировали с первичными антителами: козьими против SST, 1:200 (Santa Cruz, sc-7819), овечьими против TH, 1:1000 (Abcam, ab113), кроличьими против NPY, 1:500 (Abcam, ab30914), в течение 24 ч при комнатной температуре. После кратковременной промывки в PBS срезы инкубировали со вторичными антителами в течение 2 ч. Вторичные антитела были конъюгированы с флуорохромами – флуоресцеин изотиоцианатом (fluorescein isothiocyanate, FITC), дающим зеленую флуоресценцию, и индокарбоцианином (indocarbocyanine, CY3), дающим красную флуоресценцию (разведение 1:150, Jackson Immunoresearch, США).

Окраску клеток всей популяции нейронов проводили зеленым флуоресцентным красителем NeuroTrace™ Green Fluorescent Nissl Stains (Molecular Probes, США) – разведение 1:200. После этого срезы отмывали в PBS и заключали в среду для флуоресцентной микроскопии VectaShield (Vector Laboratories, США). Для исключения неспецифической реакции часть срезов инкубировали без первичных и/или вторичных антител.

Анализ препаратов проводился с использованием программно-аппаратного комплекса, включающего флуоресцентный микроскоп Olympus BX43 (Olympus, Япония) с набором фильтров (модуль зеркал UFBWA – синее возбуждение, фильтр возбуждения BP460-495, барьерный фильтр BA510550 – зеленая флуоресценция; модуль зеркал U-FGWА – зеленое возбуждение, фильтр возбуждения BP530-550, барьерный фильтр BA575-625 – красная флуоресценция), охлаждаемую ССD камеру Tucsen FL-20 (Xintu Photonics, Китай) и компьютер на базе процессора Intel Core i7 (Intel, США). Получение и последующая обработка изображений проводилась с использованием программы Mosaic, версия 2.1 (Xintu Photonics, Китай).

Полученные мультиканальной флуоресценцией с различными спектрами флуорохромов изображения препаратов комбинировали при помощи программы Paint Shop Pro 7.02 (Jasc Software, Inc., США), при этом накладывали снимки одного и того же поля зрения. Объединенный рисунок отображал зеленый и красный цвета и зоны их перекрытия в виде градиента желто-зеленого цвета.

Для выявления меченых нейронов использовали каждый третий из серийных срезов. Число меченых нейронов определяли на изображениях срезов площадью 0,14 мм², полученных под объективом 20х/0,50. Долю SST-IR нейронов определяли как их отношение к общему количеству нейронов, выявленных с помощью NeuroTrace™ Fluorescent NisslStains, которое принимали за 100%. Анализу подлежали нейроны, срез которых прошел через ядро с видимым ядрышком и с флуоресценцией, превышающей фоновое свечение. Число меченых нейронов, а также среднюю площадь сечения SST-IR нейронов определяли с помощью программы Image J (NIH, США). Для определения средней площади сечения при увеличении 200 вручную обводили границы IR клеток. Всего для анализа брали 200 нейронов в каждом ганглии каждой возрастной группы.

Статистическая обработка данных

Проверка на нормальность распределения случайных величин проводилась с использованием критерия Шапиро – Уилка. Значимость различий средних величин оценивалась при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для парных сравнений использовался t-критерий Стьюдента, для множественных межгрупповых сравнений использовалась поправка Бонферрони. Различия принимались как значимые при р < 0,05. Для статистического анализа данных использовалась программа Sigma Plot (Systat Software, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты показали, что иммуномечение к SST и NPY было представлено в виде гранул, заполняющих цитоплазму, в то время как иммунореактивность к TH была относительно гомогенной. В большинстве нейронов иммунореактивный материал обнаруживался в области тел, тем не менее у отдельных клеток он выявлялся и в области проксимальных дендритов.

Меченые нейроны были распределены по поверхности среза относительно равномерно. Мы не обнаружили количественных различий между левым и правым ЧГ, поэтому далее представлены усредненные данные по обоим узлам.

SST-IR нейроны не обнаруживались в КШГ, но выявлялись в солнечном сплетении. Начиная с периода новорожденности и до 24 мес. часть нейронов и в ЧГ, и в КБГ была SST-IR (рис. 1).

У новорожденных треть нейронов в ЧГ и КБГ была с IR. Доля SST-IR нейронов удваивалась в онтогенезе в обоих узлах в течение первых 30 суток жизни и сохранялась на уровне 70–73% до 24 мес. (табл. 1). Мы не наблюдали значимых различий по долям SST-IR между КБГ и ЧГ в каждой из возрастных групп.

Средняя площадь сечения SST-IR нейронов увеличивалась в ЧГ и КБГ с момента рождения до 60 суток жизни (табл. 2). С 20-х суток жизни у крыс средняя площадь сечения SST-IR нейронов в ЧГ была статистически значимо выше, чем в КБГ.

Во всех возрастных группах, с момента рождения и до 24 мес., все SST-IR нейроны ЧГ и КБГ колокализовали фермент синтеза катехоламинов TH. При этом, независимо от возраста, подавляющее большинство SST-IR нейронов (90–94%) содержали NPY (рис. 1, 2). Не было обнаружено значимых различий между долями SST-IR нейронов, колокализующих NPY, в различных возрастных группах (рис. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты настоящего исследования демонстрируют наличие SST-IR нейронов в превертебральных ЧГ и КБГ к моменту рождения, при этом в паравертебральном КШГ SST-IR нейроны не обнаружены. Доля SST-IR нейронов в превертебральных узлах у крысы превосходит аналогичный показатель у других млекопитающих, включая мышь, морскую свинку, свинью и человека: у мыши и человека обнаруживались лишь отдельные SST-IR нейроны, а у свиней и морской свинки количество SST-IR нейронов в превертебральных узлах доходит до 12–15 и 25% соответственно [5][6][13][14].

Наши более ранние данные свидетельствуют о том, что у крысы в узлах солнечного сплетения содержится больше SST-IR нейронов по сравнению с другими узлами, включая звездчатый узел [9]. Мы впервые обнаружили, что в онтогенезе крысы в первые 30 суток жизни доля SST-IR нейронов увеличивается в превертебральных симпатических узлах, в частности ЧГ и КБГ. В отличие от этого в паравертебральном звездчатом ганглии крыс наибольшее количество нейронов, содержащих SST, обнаруживалось у новорожденных животных и составляло 7% [9] В постнатальном онтогенезе в данном узле доля SST-IR нейронов уменьшается в первые 10 суток жизни до 4% [9]. Таким образом, в различных симпатических узлах доля SST-IR нейронов изменяется гетерохронно, что может быть связано с особенностями иннервируемых органов-мишеней. КШГ обеспечивает симпатическую иннервацию головы, звездчатый ганглий – органов грудной полости и шеи, а превертебральные узлы – органов брюшной полости [16][17]. Ранее нами было показано, что SST-IR нейроны, иннервирующие сердце, выявляются в звездчатом узле только у новорожденных крыс и не наблюдаются у более взрослых [18].

В данной работе мы установили, что доля SST-IR нейронов в превертебральных симпатических узлах крысы начиная с возраста 30 суток далее не изменяется до 2 лет. Согласно литературным данным, в гипоталамусе доля SST-IR нейронов у возрастных особей (2–2,5 года) этого вида животных также оставалась постоянной [19].

Продемонстрированная в данной работе более высокая средняя площадь сечения SST-IR нейронов в ЧГ по сравнению с КБГ у 20-суточных и более взрослых крыс подтверждает обнаруженные ранее данные о больших размерах NPY-IR нейронов в ЧГ относительно КБГ [8]. Нами установлено, что практически все SST-IR нейроны превертебральных узлов крыс в различные возрастные периоды также содержат TH и NPY. Нейромедиаторы SST и NPY подавляют перистальтику и секрецию в желудочно-кишечном тракте [7]. Предполагается, что NPY-IR нейроны солнечного сплетения, не содержащие SST, являются вазомоторными, а NPY/SST-IR – висцеромоторными [20]. Наибольшее число висцеромоторных волокон направляется к интрамуральным узлам межмышечного сплетения желудочно-кишечного тракта [7].

Экспрессия SST может изменяться при патологии – например, у свиньи при воспалении желудочно-кишечного тракта, включая язвенный колит и химически индуцированное воспаление нисходящей ободочной кишки, увеличивается количество данного пептида в ганглионарных нейронах [21]. Имеются данные о том, что SST подавляет воспалительные реакции в кишечнике путем двунаправленной коммуникации между нейронами и тучными клетками, также модулирует активность лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником [22]. SST стимулирует пролиферацию B-лимфобластов, при этом ингибирует активность Т-лимфоцитов, пролиферацию гранулоцитов, синтез провоспалительных цитокинов [23]. SST также участвует в соматостатинергической противовоспалительной петле (somatostatinergic anti-inflammatory loop) [24]: когда повреждающие агенты раздражают пептидергические нейроны, это вызывает высвобождение вещества P и/или кальцитонин-ген-родственного пептида (calcitonin gene-related peptide, CGRP). Последние индуцируют локальное нейрогенное воспаление, которое, в свою очередь, вызывает выброс SST из тех же нейронов. SST замыкает круг, останавливая высвобождение вышеуказанных нейропептидов, и ингибирует воспалительные процессы [24].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В раннем постнатальном онтогенезе крысы в превертебральных узлах наблюдается увеличение доли нейронов, содержащих SST, что важно для становления симпатической иннервации желудочно-кишечного тракта. SST не только тормозит моторику и секрецию, но и оказывает обез­боливающее и противовоспалительное действие в органах пищеварения. Дальнейшие эксперименты с изучением в различные возрастные периоды состава SST-рецепторов в органах-мишенях позволят уточнить особенности симпатической регуляции пищеварительной системы и разработать возможные пути фармакологической коррекции заболеваний желудочно-кишечного тракта.

ВКЛАД АВТОРОВ

А.И. Емануйлов и В.В. Порсева участвовали в сборе материала, проведении экспериментов и статистической обработке данных. А.В. Павлов и П.М. Маслюков разработали идею и дизайн исследования, а также участвовали в написании рукописи. Все авторы утвердили окончательную версию публикации.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

Andrey I. Emanuilov and Valentina V. Porseva participated in the collection of material, experiments and statistical data processing. Alexei V. Pavlov and Petr M. Masliukov developed the idea and design of the study, and contributed to the writing of the manuscript. All authors approved the final version of the publication.