Влияние введения неселективного ингибитора NO-синтазы в период беременности на развитие коры головного мозга двадцатисуточных крысят

Список сокращений

• L-NAME – N(omega)-nitro-L-arginine methyl ester, N(омега)-нитро-L-аргинин метиловый эфир
• NO – Nitric oxide, оксид азота
• NOS – Nitric oxide synthase, синтаза оксида азота

Оксид азота (nitric oxide, NO) является ключевой сигнальной молекулой, вовлеченной в функционирование различных органов и систем, в том числе в регуляцию нейротрансмиссии, вазодилатации и воспалительных реакций [1]. Синтаза оксида азота (Nitric oxide synthase, NOS), катализирующая образование NO, имеет три изоформы в зависимости от типа клеток и тканей, в состав которых она входит [2]. Нейрональная NOS (nNOS), ответственная за синтез NO нейронами, участвует в передаче сигналов нейронов, эндотелиальная NOS (eNOS) – в вазодилатации, а индуцибельная NOS (iNOS) – в иммунных ответах.

В центральной нервной системе локализованы все изоформы NOS. Синтезируемый NO участвует в регуляции кровообращения головного мозга, передачи сигнала в синапсах как ретроградный нейромедиатор и играет значимую роль во внутриклеточной передаче сигналов в нейронах – от регуляции их метаболического статуса до роста дендритных отростков. В период эмбриогенеза NO также участвует в формировании центральной и периферической нервной системы, в частности в дифференцировке нейронов, становлении синаптогенеза и церебрального кровотока [3][4].

Снижение образования NO служит главным механизмом запуска такого патологического процесса, как дисфункция эндотелия. Так, в период беременности это приводит к патологии маточно-плацентарного кровотока, нарушениям антенатального развития плода [5][6] и преэклампсии [7][8]. Тяжелый гестоз усугубляет состояние, связанное с нарушением функции плаценты, с ее васкуляризацией и часто осложняется преждевременными родами и различной патологией развития плода [9][10].

Нарушение метаболизма NO моделируется посредством введения неселективного ингибитора NO-синтазы – N(омега)-нитро-L-аргинин метилового эфира (N(omega)-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME) [11]. Применение L-NAME приводит к резкому уменьшению содержания нитрит-ионов за счет снижения экспрессии eNOS в эндотелии сосудов [2].

Применение L-NAME является широко используемой моделью экспериментальной преэклампсии [11], используется чаще всего на мышах и крысах [12]. В экспериментах при введении L-NAME беременным крысам наблюдалось развитие патологии, по своим клиническим проявлениям соответствующей гестозу: статистически значимо повышалось систолическое артериальное давление, снижалась микроциркуляция в плаценте, а также увеличивалась протеинурия [13][14]. Есть данные о неблагоприятном воздействии L-NAME на сердечно-сосудистую систему, снижении перфузии маточно-плацентарного ложа, уменьшении веса плаценты и веса потомства [15][16]. Однако влияние экспериментального ингибирования NOS в период плацентации на последующие структурные изменения нейронов в головном мозге плода изучено недостаточно.

Цель – изучить морфологические особенности нейронов коры головного мозга крысят на 20-е сутки постнатального развития в условиях введения неселективного ингибитора NO-синтазы (L-NAME) в период плацентации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на 12 беспородных белых крысах-самках одного возраста (110 ± 10 дней) из одной популяции из вивария Гродненского государственного медицинского университета массой 300 ± 20 г и их потомстве. Животных содержали в стандартных поликарбонатных клетках объемом 16 300 см³. Кормление осуществляли с использованием сертифицированного сбалансированного гранулированного корма для грызунов и фильтрованной водопроводной воды ad libitum. Крысы находились в отдельных помещениях для содержания лабораторных животных в контролируемых условиях окружающей среды (20–26 °C при относительной влажности 30–70%) с 12-часовым циклом освещения и 10-кратной сменой объема воздуха в час.

Беспородных белых самцов массой 380 ± 20 г из расчета 1 самец на 3 самки подсаживали к последним после 18.00 для оплодотворения, а выявление беременности проводили на следующий день до 9.00 утра по наличию сперматозоидов во влагалищных мазках. После оплодотворения самок содержали по 1 особи в клетке в одинаковых условиях, после родов – вместе с родившимся потомством. Для всех самок наступившая беременность была первой.

Беременных крыс опытной и контрольной групп рандомно разделили на 2 группы по 6 самок в каждой. Крысам опытной группы вводили L-NAME в дозе 25 мг/кг на 11-е сутки беременности (период плацентации) однократно внутримышечно. Доза выбрана согласно данным литературы [11]. Контрольной группе вводили 0,9% раствор NaCl однократно внутримышечно в тот же срок беременности. Роды наступали на 24 ± 2 день беременности.

После родов крысята содержались в клетках со своими матерями при вышеописанных условиях. Формирование выборки животных производилось случайным образом с исключением крысят с явными анатомическими и/или поведенческими особенностями. Взятие головного мозга осуществляли на 20-е сутки постнатального развития – в период пубертатного возраста и завершения базового синаптогенеза. Выведение крысят из эксперимента осуществлялось при помощи эфирного наркоза с последующей быстрой декапитацией. Далее извлекали головной мозг, кусочки переднего отдела коры больших полушарий фиксировали в жидкости Карнуа. Готовили серийные парафиновые срезы, которые окрашивали 0,1% толуидиновым синим по методу Ниссля [17].

Изучение гистологических препаратов, микрофотографирование, морфометрию нейронов проводили с помощью микроскопа Axioscop 2 plus (Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры Leica DFC320 (Leica Camera AG, Германия) и программы анализа изображения ImageWarp (Bitflow, США). Расположение фронтальной коры в гистологических препаратах мозга крысят определяли с помощью стереотаксического атласа [17]. У каждого животного контрольной группы оценивали не менее 30 нейронов, а экспериментальной – 150 нейронов пятого слоя коры головного мозга, что обеспечивало достаточный объем выборки для последующего анализа.

В данном исследовании были изучены размеры и форма нервных клеток (мкм²), а также выраженность их окраски толуидиновым синим [18]. С целью более точного подсчета нейронов разной степени хроматофилии цитоплазмы в фотографии гистологического препарата моделировалась сетка с ее последующим наложением на фото изучаемой области головного мозга в программе Microsoft Word (Microsoft Office, США). Сетка представляет собой таблицу, соответствующую размеру полученного изображения (123×165 мм), с десятью равными ячейками размером 24,7×33,0 мм. Во всех ячейках сетки, соответствующей площади участка гистологического препарата с учетом увеличения микроскопа, осуществлялся подсчет нейронов разной степени хроматофилии цитоплазмы (нормохромные, гипохромные, гиперхромные, гиперхромные сморщенные) с последующим определением их процентного содержания к общему количеству нейронов в сетке или абсолютного количества на 1 мм².

Для изучения размеров и формы перикарионов измеряли площадь, фактор элонгации (отношение максимального и минимального диаметров) и формфактор (отношение 4-х площадей к периметру в квадрате) в условных единицах. Для наглядного отображения формы нейронов коры головного мозга использовался шаблон геометрической фигуры овала в программе Microsoft Word (Microsoft Office, США) с указанием параметров «ширина» – Ш и «высота» – В. Параметры овала задавались в окне свойств фигуры «Размер» пропорционально геометрическим размерам нейронов.

Представленная работа является продолжением опубликованной нами ранее работы [19], в которой мы изучали эти же параметры у новорожденных крысят в аналогичных условиях.

Статистический анализ

В результате гистологических исследований получены количественные непрерывные данные, которые обрабатывали с помощью программы Statistica 13.0 (TIBCO, США). Так как в эксперименте использованы малые выборки, которые имели ненормальное распределение, анализ проводили методами непараметрической статистики. Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25-й; 75-й процентили) [20]. Для сравнения групп применялся критерий Манна – Уитни, критерий хи-квадрат Пирсона. Различия между показателями считали статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При изучении плотности расположения нейронов на 1 мм² фронтальной коры головного мозга у двадцатисуточных крысят была выявлена тенденция к уменьшению на 10% количества клеток у потомства, рожденного самками с пренатальным введением L-NAME, в сравнении с контрольной группой (p > 0,05).

Также в опытной группе выявлена тенденция к уменьшению площади нейронов на 22% (разница между группами не значима) и изменение формы перикарионов в сторону их большей вытянутости за счет статистически значимого увеличения фактора элонгации на 0,3 ед., в то время как форм-фактор не изменялся (табл.).

У двадцатисуточных крысят контрольной группы в пятом слое фронтальной коры головного мозга преобладали нормохромные нейроны (рис. 1).

Доли нейронов с различной выраженностью окраски статистически значимо различались в исследованных группах. В опытной группе животных, рожденных самками с пренатальным введением L-NAME, отмечалось уменьшение доли нормохромных нейронов до 80% (по сравнению с 95% в контрольной), шестикратное увеличение доли гиперхромных нейронов, появление гиперхромных сморщенных нейронов. По долям гипохромных нейронов группы не различались (рис. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ

Введение L-NAME – неселективного ингибитора NO-синтазы на 11-е сутки беременности (период плацентации) приводило у двадцатисуточных крысят опытной группы к уменьшению доли нормохромных нейронов, увеличению доли гиперхромных нейронов и появлению гиперхромных сморщенных нейронов, отсутствовавших у крысят контрольной группы. Также при введении L-NAME отмечалась тенденция к снижению плотности расположения нейронов в пятом слое коры головного мозга, форма изменялась из круглой на вытянутую. Данный эффект при введении L-NAME может быть обусловлен снижением образования NO как в нейронах, так и в эндотелии сосудов, что ведет к нарушению клеточного метаболизма, вазодилататорных компенсаторных механизмов с развитием ишемии и водно-электролитного дисбаланса, в порочном круге усугубляющих деформацию тел нейронов и их сморщивание [21][22].

В нашей предыдущей работе [19], выполненной на новорожденных крысятах, рожденных в аналогичных условиях, в группе после введения L-NAME фактор элонгации был равен 1,24 (1,21; 1,30) ед., форм-фактор 0,87 (0,81; 0,88), доля нормохромных нейронов составила 95%, гипохромных и гипер­хромных – по 2,5%, гиперхромных сморщенных нейронов не было выявлено. Полученные данные в представленной работе могут свидетельствовать о развитии и прогрессировании постнатальных изменений в центральной нервной системе крысят, подвергнутых введению неселективного ингибитора NO-синтазы в период плацентации.

Предполагается, что интенсивная окраска цитоплазмы нейронов характеризует преобладание образования белка над его утилизацией. Некоторые исследователи расценивают гиперхромные нейроны как гиперфункциональные и считают, что синтезированный ими белок идет на их собственные потребности [23]. Хотя многие авторы изучали гиперхромные нейроны, тем не менее сведения о них весьма противоречивы и вынести по ним суж­дение о сущности и функциональном значении данного явления довольно трудно [23][24].

Существует мнение, согласно которому появление гиперхромных и гиперхромных сморщенных нейронов связано со снижением их функциональной активности и отражает происходящие в них процессы торможения. Подтверждением низкой функциональной активности гиперхромных сморщенных нейронов служат описываемые в литературе результаты электронно-микроскопического и ауторадиографического исследования, показывающие двукратное снижение скорости выведения вновь синтезированной рибонуклеиновой кислоты из ядра в цитоплазму клетки [22]. Описанные в литературе данные об электронной микроскопии гиперхромных несморщенных нейронов свидетельствуют о содержании большого количества канальцев гранулярной эндоплазматической сети в описанных клетках [24]. Также, в них повышено и количество свободных рибосом. В то же время гиперхромные нейроны имеют меньшее число митохондрий по сравнению с нормохромными. Ядра и цитоплазма гиперхромных сморщенных нейронов темные и покрыты многочисленными складками. Для данного типа нейронов характерны дезорганизация и деструктивные изменения органелл, наблюдается значительное расширение канальцев гранулярной эндоплазматической сети и комплекса Гольджи, свободные рибосомы образуют поля и скопления, отмечается набухание митохондрий и деградация их крист [23].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Введение крысам в период плацентации неселективного ингибитора NO-синтазы L-NAME приводит к морфологическим нарушениям нейронов фронтальной коры головного мозга крысят, проявляющимся в пубертатном возрасте уменьшением размеров клеток, увеличением доли гиперхромных и появлением гиперхромных сморщенных нейронов наряду с уменьшением доли нормохромных нейронов, что, по всей видимости, является следствием снижения образования оксида азота как в самих нейронах, так и в эндотелии сосудов, питающих головной мозг.

ВКЛАД АВТОРОВ

Н.Е. Максимович внесла основной вклад в разработку концепции и дизайна исследования, руководила процессом написания статьи. Т.С. Русак, Е.И. Бонь провели эксперимент с животными, статистическую обработку данных и редактирование статьи. А.Д. Бернацкая, А.С. Кусмарцева внесли вклад в поиск литературных источников, а также подготовили иллюстрации. Все авторы одобрили окончательный вариант статьи и готовы взять на себя ответственность за все аспекты представленной публикации.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

Nataliya Ye. Maksimovich made the main contribution to the development of the concept and design of the study, supervised the process of writing the article. Tatiana S. Rusak, Elizaveta I. Bon made an experiment with animals, carried out statistical data processing and editing the article. Anna D. Bernatskaya, Angelina S. Kusmartseva contributed to the literature review and prepared illustrations. All authors approved the final version of the article and are ready to take responsibility for all aspects of the submitted publication.