Структурные изменения мышечной ткани наружного сфинктера прямой кишки на фоне экспериментальной андрогенной недостаточности

Список сокращений:

• НСПК – наружный сфинктер прямой кишки

Гипогонадизм – это клинический и биохимический синдром, связанный с низким уровнем тестостерона, а также нечувствительностью рецепторного аппарата к андрогенам, который может оказывать негативное воздействие на множество органов и систем, ухудшая качество жизни¹. Первичная форма гипогонадизма связана с недостаточной функцией семенников, вследствие чего уровень тестостерона в мужском организме снижается. Наиболее простым экспериментальным способом формирования первичного гипогонадизма является двусторонняя орхиэктомия.

Известно, что андрогенный дефицит распространен среди значительной части мужского населения. По данным исследований, проведенных в Европе и США, распространенность гипогонадизма среди мужчин среднего и старшего возраста варьирует от 2,1 до 12,8%, более высокие показатели распространенности отмечены среди пациентов с сопутствующими заболеваниями, такими как сахарный диабет 2-го типа – 51% и ожирение – от 15 до 78,8% [1].

Тестостерон, представляющий собой анаболический стероидный гормон, важен не только для процессов полового созревания, сексуальной активности и воспроизводства потомства, но и других процессов, в частности формирования и поддержания скелетной мышечной ткани [2]. В мышечных тканях тестостерон стимулирует синтез белков и ингибирует их дегенерацию, стимулирует коммитирование мезенхимальных плюрипотентных клеток в миогенную линию и повышает синтез сократительных белков, что способствует гипертрофии мышечных волокон [3–5]. Литературные данные указывают на взаимосвязь между низким уровнем андрогенов в сыворотке крови и возрастной потерей скелетной мышечной массы (саркопенией) [6][7].

Одной из нерешенных клинических проблем служит фекальная инконтиненция, характеризующаяся нарушением работы наружного сфинктера прямой кишки (НСПК), состоящего из поперечнополосатых мышц [8]. В модели фекальной инконтиненции, созданной после овариоэктомии на крысах-самках, показано увеличение толщины мышц анального сфинктера после введения тестостерона [9]. При этом вопрос об изменениях в структуре и метаболических процессах в НСПК в условиях дефицита тестостерона остается малоизученным.

Цель исследования: изучить микроскопическое и ультрамикроскопическое строение поперечнополосатой мышечной ткани НСПК лабораторных половозрелых крыс-самцов в условиях экспериментальной андрогенной недостаточности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент проводился в Институте экспериментальной медицины и биотехнологий ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России на белых лабораторных крысах.

Для исследования влияния дефицита тестостерона на морфологическое строение НСПК брали 10 здоровых половозрелых самцов крысы в возрасте 8 месяцев массой 300–350 г. Животные содержались в полипропиленовых клетках с гранулированной подстилкой в постоянно контролируемой среде: температура 22 ± 1 °C, влажность 55 ± 10%, 12/12-часовой цикл свет/темнота, и имели свободный доступ к пище и воде.

Самцов во временной точке 1 разделили рандомно на 2 группы по 5 крыс в каждой: интактную (контрольную) и экспериментальную с моделированной андрогенной недостаточностью. Последнюю создавали путем двухсторонней кастрации (рис. 1). Все оперативные вмешательства на животных проводились под внутримышечным наркозом смеси анестетиков тилетамина с золазепамом (Virbac C.A., Франция) в дозировке 15 мг/кг веса и ксилазина гидрохлорида (Bioveta, Чешская республика) в дозировке 6 мг/кг веса. Далее животных фиксировали на операционном столе, проводили рассечение мошонки, извлекали семенник, накладывали лигатуру вокруг семенных канатиков и пересекали их.

В точке 1, на 30-е (точка 2) и 45-е сутки (точка 3) после проведения орхиэктомии определяли концентрацию тестостерона в сыворотке крови крыс с помощью иммунохемилюминисцентного анализа (ACCESS 2, Beckman Coulter Inc, США) (рис. 1).

Забор материала для морфологического изучения осуществляли на 45-е сутки моделированного гипогонадизма после медикаментозной эвтаназии посредством внутрисердечной инъекции препаратов, использованных в точке 1 для наркоза, в летальных дозах. После отделения кожной части анального отверстия и выделения прямой кишки нижнюю треть фиксировали в 10% нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН 7,4), обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации: 30º, 50º, 70º, 90º, 96º (I), 96º (II) до абсолютного спирта и заливали в парафин. Гистологические срезы получали толщиной 5–7 мкм на ротационном микротоме Sakura Accu-Cut SRM 200 (Япония) и окрашивали по стандартной методике гематоксилином и эозином

Гистологические препараты просматривали в световом микроскопе Leica DM3000 (Германия), снабженным цифровой камерой и программой для проведения линейных измерений. Определяли диаметр мышечных волокон и толщину эндомизия; с использованием планиметрической (25-точечной) сетки Г.Г. Автандилова методом гистостереометрии изучалась площадь мышечных волокон и соединительной ткани.

Для ультраструктурного анализа материал фиксировали в 1% глутаровом альдегиде (рН 7,4) в течение 12 часов. Далее материал переносили в 2,5% раствор глутарового альдегида на 4 часа, затем на 2 часа помещали в 1% тетраокись осмия. Обезвоживание проводили в серии спиртов возрастающей концентрации и в окиси пропилена, после чего заливали в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы образцов толщиной 60–80 нм получали на микротоме Leica UC7 (Германия), помещали на медные сеточки и окрашивали 20 минут насыщенным раствором уранилацетата и 5 минут цитратом свинца. Исследование методом просвечивающей электронной микроскопии проводили на электронном микроскопе Hitachi HT 7700 Exalens (Hitachi High-Tech Corporation, Япония) на базе лаборатории «Электронная микроскопия» междисциплинарного центра «Аналитической микроскопии» Казанского федерального университета. Ультраструктурное исследование мышечных волокон включало в себя оценку площади миофибрилл и цитоплазмы, выявление гранул гликогена в цитоплазме и межмиофибриллярном пространстве, а также определение изменений в митохондриях.

Статистический анализ

Непрерывные данные, полученные в ходе исследования, представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25-й; 75-й процентили). Для определения статистической значимости различий между значениями в экспериментальной группе и группе контроля использовали непараметрический критерий Манна – Уитни. Различия считали значимыми при p < 0,05.

Статистический анализ данных выполнен при помощи программы IBM SPSS v.23.0 (SPSS: An IBM Company, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исходный уровень тестостерона в обеих группах не отличался. В экспериментальной группе после кастрации уровень тестостерона снизился к 30-м суткам в 2,5 раза и далее не изменялся до 45 суток, в контрольной группе концентрация тестостерона не изменялась на протяжении всего эксперимента (табл.).

При светооптическом исследовании образцов обнаружено, что состав наружного сфинктера прямой кишки, имеющего общее строение с мышечной тканью локомоторного типа и представленного поперечнополосатой мускулатурой, отличается по количеству мышечных волокон и интерстиция у экспериментальной и контрольной групп животных (рис. 1).

При морфометрии диаметр мышечных волокон НСПК у животных с экспериментально смоделированным гипогонадизмом был в 1,5 раза меньше диаметра мышц аналогичного участка контрольной группы (табл.).

Уменьшение диаметра мышечных волокон у экспериментальной группы крыс-самцов сочеталось с увеличением толщины эндомизия, которая в 2 раза превышала аналогичные значения в контрольной группе (табл.). По клеточному составу различий в исследованных образцах эндомизия не обнаружено, он был представлен рыхлой соединительной тканью.

У крыс с моделированным дефицитом тестостерона площадь мышечной ткани была меньше в 1,3 раза, а соединительной ткани – в 1,9 раза больше по сравнению с таковым у животных контрольной группы. Изучение соотношения «площадь мышечных волокон / площадь соединительной ткани» в области НСПК показало, что в экспериментальной группе оно было в 2,5 раза меньше, чем в контрольной.

При ультраструктурном исследовании поперечнополосатой мышечной ткани НСПК получены следующие данные: у животных экспериментальной группы площадь миофибрилл была меньше в 1,9 раза, а площадь цитоплазмы больше в 3,5 раза аналогичных показателей в контрольной группе. Соотношение «площадь миофибрилл / площадь цитоплазмы» было в 6,6 раза меньше в экспериментальной группе по сравнению с контрольной (табл.).

В мышечных волокнах экспериментальной группы с увеличением объема цитоплазмы наблюдался рост количества гранул гликогена, который располагался повсеместно: между миофибриллами, между миофиламентами и в пространстве вокруг ядра. Наряду с этим выявлялись патологические формы митохондрий: чаще всего встречались изменения в виде набухания, деструкции крист и вакуолизации их матрикса (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования как на светооптическом, так и на ультрамикроскопическом уровнях показали, что в организме половозрелых крыс-самцов на 45-е сутки моделированного гипогонадизма с лабораторно подтвержденным дефицитом тестостерона (концентрация ниже группы контроля в 2,5 раза) происходит уменьшение диаметра поперечнополосатых мышечных волокон НСПК в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой. Вероятно, в ответ на атрофические изменения в мышечных волокнах в качестве компенсации потери объема мышечной ткани увеличивается количество соединительной ткани в интерстиции в 2 раза по сравнению с контрольной группой.

Продемонстрированная в нашей работе атрофия мышечных волокон наружного сфинктера прямой кишки в условиях дефицита тестостерона объясняется анаболическим действием гормона на скелетную мышечную ткань, содержащую огромное количество андрогеновых рецепторов. В условиях андрогенного дефицита, по-видимому, замедляется синтез белков (строительного компонента миофибрилл) в мышцах [10].

Наряду с уменьшением количества миофибрилл и нарушением связей между миофиламентами происходит нарушение строения митохондрий, которые обеспечивают снабжение мышечного волокна энергией в виде АТФ, свободные пространства саркоплазмы заполняются гранулами гликогена. Все эти процессы могут быть свидетельством компенсаторно-приспособительных механизмов, возникающих в исчерченной мышечной ткани НСПК при дефиците тестостерона.

Спектр изменений митохондрий, наблюдаемых в экспериментальной группе (набухание, деструкция крист и вакуолизация матрикса), может быть следствием нескольких факторов, возникающих в ответ на недостаток тестостерона. Во-первых, в научной литературе есть данные о том, что дефицит тестостерона вызывает снижение катаболизма энергетических субстратов (глюкозы и жирных кислот) в митохондриях во время производства АТФ и тепла. В результате в ответ на избыток энергии в виде топливного субстрата, накапливающегося в цитоплазме мышечных волокон, может нарушаться структура митохондрий. Во-вторых, одним из факторов, вызывающих нарушение строения и функционирование митохондрий, является гипоксия. Известно, что эритропоэз – тестостеронзависимый процесс [11]. Поскольку при снижении концентрации андрогенов после кастрации происходит уменьшение активности эритропоэза, это, безусловно, приводит к снижению количества доставляемого кислорода и, следовательно, гипоксии клеток. При гипоксии происходит подавление дыхательной цепи в пользу гликолиза, что, в свою очередь, приводит к закислению среды, перегрузке натрием, снижению накопления кальция и нарушению выработки АТФ. Все эти процессы, возникающие в митохондриях в ответ на гипоксию, ведут к увеличению проницаемости внутренней мембраны и в дальнейшем к деструкции или набуханию митохондрий [12]. Наконец, еще одним фактором, который может спровоцировать нарушение структуры митохондрий, является увеличение содержания активных форм кислорода с понижением концентрации андрогенов, которые усиливают окислительное повреждение дыхательной цепи [13].

Ранее было показано, что в ответ на снижение уровня андрогенов мышечные волокна теряют свою массу и частично замещаются жировой тканью, но после введения заместительной терапии доля мышечной массы восстанавливается [14][15].

Действительно, полученная нами микроскопическая и ультрамикроскопическая картина при гипогонадизме подтверждает вероятность атрофических изменений в мышечных волокнах, что проявляется в частичной потере миофибриллярного аппарата и замещении его соединительной тканью.

Наши данные об увеличении количества гликогена в мышечных волокнах при гипогонадизме разнятся с данными литературы, которые сообщают о возможном снижении чувствительности клеток к инсулину при дефиците тестостерона, в связи с чем прекращается поступление глюкозы внутрь клеток и, соответственно, прекращается образование внутриклеточного гликогена [16]. С другой стороны, увеличение количества гликогена и дистрофические изменения в митохондриях в мышечной ткани при снижении тестостерона являются свидетельством преобладания анаэробного типа энергетического обмена и, следовательно, перестройки метаболического профиля, что, скорее всего, служит признаком адаптивных изменений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В условиях смоделированного дефицита тестостерона в период половой зрелости крыс-самцов в поперечнополосатой мускулатуре НСПК наряду с атрофическими процессами развиваются компенсаторно-приспособительные процессы, направленные на восстановление метаболической и функциональной организации. Полученные результаты вносят вклад в понимание механизмов развития фекальной инконтиненции в условиях андрогенного дефицита и могут служить основой для проведения дальнейших исследований.

ВКЛАД АВТОРОВ

А.С. Пронина внесла значительный вклад в разработку концепции идеи, проведение эксперимента и обработку данных, статистическую обработку результатов исследования, подготовку рукописи. Г.Н. Суворова внесла основной вклад в разработку концепции идеи и методологии проведения эксперимента, а также написание текста рукописи. Н.Н. Вологдина участвовала в обработке данных и редактировании текста статьи. Все авторы утвердили окончательную версию статьи.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

Antonina S. Pronina: study concept and design, acquisition of data, analysis and interpretation of data, statistical analysis, drafting of the manuscript. Galina N. Suvorova: study concept and design of the experiment, drafting of the manuscript. Natalya N. Vologdina: analysis and interpretation of data, drafting of the manuscript. All authors approved the final version of the publication.