Структурные изменения мышечной ткани наружного сфинктера прямой кишки на фоне экспериментальной андрогенной недостаточности

Список сокращений:

• НСПК – наружный сфинктер прямой кишки

Гипогонадизм – это клинический и биохимический синдром, связанный с низким уровнем тестостерона, а также нечувствительностью рецепторного аппарата к андрогенам, который может оказывать негативное воздействие на множество органов и систем, ухудшая качество жизни¹. Первичная форма гипогонадизма связана с недостаточной функцией семенников, вследствие чего уровень тестостерона в мужском организме снижается. Наиболее простым экспериментальным способом формирования первичного гипогонадизма является двусторонняя орхиэктомия.

Известно, что андрогенный дефицит распространен среди значительной части мужского населения. По данным исследований, проведенных в Европе и США, распространенность гипогонадизма среди мужчин среднего и старшего возраста варьирует от 2,1 до 12,8%, более высокие показатели распространенности отмечены среди пациентов с сопутствующими заболеваниями, такими как сахарный диабет 2-го типа – 51% и ожирение – от 15 до 78,8% [1].

Тестостерон, представляющий собой анаболический стероидный гормон, важен не только для процессов полового созревания, сексуальной активности и воспроизводства потомства, но и других процессов, в частности формирования и поддержания скелетной мышечной ткани [2]. В мышечных тканях тестостерон стимулирует синтез белков и ингибирует их дегенерацию, стимулирует коммитирование мезенхимальных плюрипотентных клеток в миогенную линию и повышает синтез сократительных белков, что способствует гипертрофии мышечных волокон [3–5]. Литературные данные указывают на взаимосвязь между низким уровнем андрогенов в сыворотке крови и возрастной потерей скелетной мышечной массы (саркопенией) [6][7].

Одной из нерешенных клинических проблем служит фекальная инконтиненция, характеризующаяся нарушением работы наружного сфинктера прямой кишки (НСПК), состоящего из поперечнополосатых мышц [8]. В модели фекальной инконтиненции, созданной после овариоэктомии на крысах-самках, показано увеличение толщины мышц анального сфинктера после введения тестостерона [9]. При этом вопрос об изменениях в структуре и метаболических процессах в НСПК в условиях дефицита тестостерона остается малоизученным.

Цель исследования: изучить микроскопическое и ультрамикроскопическое строение поперечнополосатой мышечной ткани НСПК лабораторных половозрелых крыс-самцов в условиях экспериментальной андрогенной недостаточности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент проводился в Институте экспериментальной медицины и биотехнологий ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России на белых лабораторных крысах.

Для исследования влияния дефицита тестостерона на морфологическое строение НСПК брали 10 здоровых половозрелых самцов крысы в возрасте 8 месяцев массой 300–350 г. Животные содержались в полипропиленовых клетках с гранулированной подстилкой в постоянно контролируемой среде: температура 22 ± 1 °C, влажность 55 ± 10%, 12/12-часовой цикл свет/темнота, и имели свободный доступ к пище и воде.

Самцов во временной точке 1 разделили рандомно на 2 группы по 5 крыс в каждой: интактную (контрольную) и экспериментальную с моделированной андрогенной недостаточностью. Последнюю создавали путем двухсторонней кастрации (рис. 1). Все оперативные вмешательства на животных проводились под внутримышечным наркозом смеси анестетиков тилетамина с золазепамом (Virbac C.A., Франция) в дозировке 15 мг/кг веса и ксилазина гидрохлорида (Bioveta, Чешская республика) в дозировке 6 мг/кг веса. Далее животных фиксировали на операционном столе, проводили рассечение мошонки, извлекали семенник, накладывали лигатуру вокруг семенных канатиков и пересекали их.

В точке 1, на 30-е (точка 2) и 45-е сутки (точка 3) после проведения орхиэктомии определяли концентрацию тестостерона в сыворотке крови крыс с помощью иммунохемилюминисцентного анализа (ACCESS 2, Beckman Coulter Inc, США) (рис. 1).

Забор материала для морфологического изучения осуществляли на 45-е сутки моделированного гипогонадизма после медикаментозной эвтаназии посредством внутрисердечной инъекции препаратов, использованных в точке 1 для наркоза, в летальных дозах. После отделения кожной части анального отверстия и выделения прямой кишки нижнюю треть фиксировали в 10% нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН 7,4), обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации: 30º, 50º, 70º, 90º, 96º (I), 96º (II) до абсолютного спирта и заливали в парафин. Гистологические срезы получали толщиной 5–7 мкм на ротационном микротоме Sakura Accu-Cut SRM 200 (Япония) и окрашивали по стандартной методике гематоксилином и эозином

Гистологические препараты просматривали в световом микроскопе Leica DM3000 (Германия), снабженным цифровой камерой и программой для проведения линейных измерений. Определяли диаметр мышечных волокон и толщину эндомизия; с использованием планиметрической (25-точечной) сетки Г.Г. Автандилова методом гистостереометрии изучалась площадь мышечных волокон и соединительной ткани.

Для ультраструктурного анализа материал фиксировали в 1% глутаровом альдегиде (рН 7,4) в течение 12 часов. Далее материал переносили в 2,5% раствор глутарового альдегида на 4 часа, затем на 2 часа помещали в 1% тетраокись осмия. Обезвоживание проводили в серии спиртов возрастающей концентрации и в окиси пропилена, после чего заливали в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы образцов толщиной 60–80 нм получали на микротоме Leica UC7 (Германия), помещали на медные сеточки и окрашивали 20 минут насыщенным раствором уранилацетата и 5 минут цитратом свинца. Исследование методом просвечивающей электронной микроскопии проводили на электронном микроскопе Hitachi HT 7700 Exalens (Hitachi High-Tech Corporation, Япония) на базе лаборатории «Электронная микроскопия» междисциплинарного центра «Аналитической микроскопии» Казанского федерального университета. Ультраструктурное исследование мышечных волокон включало в себя оценку площади миофибрилл и цитоплазмы, выявление гранул гликогена в цитоплазме и межмиофибриллярном пространстве, а также определение изменений в митохондриях.

Статистический анализ

Непрерывные данные, полученные в ходе исследования, представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25-й; 75-й процентили). Для определения статистической значимости различий между значениями в экспериментальной группе и группе контроля использовали непараметрический критерий Манна – Уитни. Различия считали значимыми при p < 0,05.

Статистический анализ данных выполнен при помощи программы IBM SPSS v.23.0 (SPSS: An IBM Company, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исходный уровень тестостерона в обеих группах не отличался. В экспериментальной группе после кастрации уровень тестостерона снизился к 30-м суткам в 2,5 раза и далее не изменялся до 45 суток, в контрольной группе концентрация тестостерона не изменялась на протяжении всего эксперимента (табл.).

При светооптическом исследовании образцов обнаружено, что состав наружного сфинктера прямой кишки, имеющего общее строение с мышечной тканью локомоторного типа и представленного поперечнополосатой мускулатурой, отличается по количеству мышечных волокон и интерстиция у экспериментальной и контрольной групп животных (рис. 1).

При морфометрии диаметр мышечных волокон НСПК у животных с экспериментально смоделированным гипогонадизмом был в 1,5 раза меньше диаметра мышц аналогичного участка контрольной группы (табл.).

Уменьшение диаметра мышечных волокон у экспериментальной группы крыс-самцов сочеталось с увеличением толщины эндомизия, которая в 2 раза превышала аналогичные значения в контрольной группе (табл.). По клеточному составу различий в исследованных образцах эндомизия не обнаружено, он был представлен рыхлой соединительной тканью.

У крыс с моделированным дефицитом тестостерона площадь мышечной ткани была меньше в 1,3 раза, а соединительной ткани – в 1,9 раза больше по сравнению с таковым у животных контрольной группы. Изучение соотношения «площадь мышечных волокон / площадь соединительной ткани» в области НСПК показало, что в экспериментальной группе оно было в 2,5 раза меньше, чем в контрольной.

При ультраструктурном исследовании поперечнополосатой мышечной ткани НСПК получены следующие данные: у животных экспериментальной группы площадь миофибрилл была меньше в 1,9 раза, а площадь цитоплазмы больше в 3,5 раза аналогичных показателей в контрольной группе. Соотношение «площадь миофибрилл / площадь цитоплазмы» было в 6,6 раза меньше в экспериментальной группе по сравнению с контрольной (табл.).

В мышечных волокнах экспериментальной группы с увеличением объема цитоплазмы наблюдался рост количества гранул гликогена, который располагался повсеместно: между миофибриллами, между миофиламентами и в пространстве вокруг ядра. Наряду с этим выявлялись патологические формы митохондрий: чаще всего встречались изменения в виде набухания, деструкции крист и вакуолизации их матрикса (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования как на светооптическом, так и на ультрамикроскопическом уровнях показали, что в организме половозрелых крыс-самцов на 45-е сутки моделированного гипогонадизма с лабораторно подтвержденным дефицитом тестостерона (концентрация ниже группы контроля в 2,5 раза) происходит уменьшение диаметра поперечнополосатых мышечных волокон НСПК в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой. Вероятно, в ответ на атрофические изменения в мышечных волокнах в качестве компенсации потери объема мышечной ткани увеличивается количество соединительной ткани в интерстиции в 2 раза по сравнению с контрольной группой.

Продемонстрированная в нашей работе атрофия мышечных волокон наружного сфинктера прямой кишки в условиях дефицита тестостерона объясняется анаболическим действием гормона на скелетную мышечную ткань, содержащую огромное количество андрогеновых рецепторов. В условиях андрогенного дефицита, по-видимому, замедляется синтез белков (строительного компонента миофибрилл) в мышцах [10].

Наряду с уменьшением количества миофибрилл и нарушением связей между миофиламентами происходит нарушение строения митохондрий, которые обеспечивают снабжение мышечного волокна энергией в виде АТФ, свободные пространства саркоплазмы заполняются гранулами гликогена. Все эти процессы могут быть свидетельством компенсаторно-приспособительных механизмов, возникающих в исчерченной мышечной ткани НСПК при дефиците тестостерона.

Спектр изменений митохондрий, наблюдаемых в экспериментальной группе (набухание, деструкция крист и вакуолизация матрикса), может быть следствием нескольких факторов, возникающих в ответ на недостаток тестостерона. Во-первых, в научной литературе есть данные о том, что дефицит тестостерона вызывает снижение катаболизма энергетических субстратов (глюкозы и жирных кислот) в митохондриях во время производства АТФ и тепла. В результате в ответ на избыток энергии в виде топливного субстрата, накапливающегося в цитоплазме мышечных волокон, может нарушаться структура митохондрий. Во-вторых, одним из факторов, вызывающих нарушение строения и функционирование митохондрий, является гипоксия. Известно, что эритропоэз – тестостеронзависимый процесс [11]. Поскольку при снижении концентрации андрогенов после кастрации происходит уменьшение активности эритропоэза, это, безусловно, приводит к снижению количества доставляемого кислорода и, следовательно, гипоксии клеток. При гипоксии происходит подавление дыхательной цепи в пользу гликолиза, что, в свою очередь, приводит к закислению среды, перегрузке натрием, снижению накопления кальция и нарушению выработки АТФ. Все эти процессы, возникающие в митохондриях в ответ на гипоксию, ведут к увеличению проницаемости внутренней мембраны и в дальнейшем к деструкции или набуханию митохондрий [12]. Наконец, еще одним фактором, который может спровоцировать нарушение структуры митохондрий, является увеличение содержания активных форм кислорода с понижением концентрации андрогенов, которые усиливают окислительное повреждение дыхательной цепи [13].

Ранее было показано, что в ответ на снижение уровня андрогенов мышечные волокна теряют свою массу и частично замещаются жировой тканью, но после введения заместительной терапии доля мышечной массы восстанавливается [14][15].

Действительно, полученная нами микроскопическая и ультрамикроскопическая картина при гипогонадизме подтверждает вероятность атрофических изменений в мышечных волокнах, что проявляется в частичной потере миофибриллярного аппарата и замещении его соединительной тканью.

Наши данные об увеличении количества гликогена в мышечных волокнах при гипогонадизме разнятся с данными литературы, которые сообщают о возможном снижении чувствительности клеток к инсулину при дефиците тестостерона, в связи с чем прекращается поступление глюкозы внутрь клеток и, соответственно, прекращается образование внутриклеточного гликогена [16]. С другой стороны, увеличение количества гликогена и дистрофические изменения в митохондриях в мышечной ткани при снижении тестостерона являются свидетельством преобладания анаэробного типа энергетического обмена и, следовательно, перестройки метаболического профиля, что, скорее всего, служит признаком адаптивных изменений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В условиях смоделированного дефицита тестостерона в период половой зрелости крыс-самцов в поперечнополосатой мускулатуре НСПК наряду с атрофическими процессами развиваются компенсаторно-приспособительные процессы, направленные на восстановление метаболической и функциональной организации. Полученные результаты вносят вклад в понимание механизмов развития фекальной инконтиненции в условиях андрогенного дефицита и могут служить основой для проведения дальнейших исследований.

ВКЛАД АВТОРОВ

А.С. Пронина внесла значительный вклад в разработку концепции идеи, проведение эксперимента и обработку данных, статистическую обработку результатов исследования, подготовку рукописи. Г.Н. Суворова внесла основной вклад в разработку концепции идеи и методологии проведения эксперимента, а также написание текста рукописи. Н.Н. Вологдина участвовала в обработке данных и редактировании текста статьи. Все авторы утвердили окончательную версию статьи.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

Antonina S. Pronina: study concept and design, acquisition of data, analysis and interpretation of data, statistical analysis, drafting of the manuscript. Galina N. Suvorova: study concept and design of the experiment, drafting of the manuscript. Natalya N. Vologdina: analysis and interpretation of data, drafting of the manuscript. All authors approved the final version of the publication.

Соответствие принципам этики. Исследование проведено с соблюдением положений Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей. Все манипуляции с животными проведены в соответствии с разрешением Локального этического комитета ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России (№ 195-10.10.2018).

Доступ к данным исследования. Данные, подтверждающие выводы этого исследования, можно получить у авторов по обоснованному запросу.

Данные и статистические методы, представленные в статье, прошли статистическое рецензирование редактором журнала – сертифицированным специалистом по биостатистике.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки (собственные ресурсы).

Ethics statements. The study complies with the standards of the EU Directive for the Protection of the Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes. Аll manipulations with animals were approved by the Local Bioethics Committee of the Samara State Medical University, No. 195 of 10.10.2018.

Data availability. The data that support the findings of this study are available from the corresponding authors on reasonable request. Data and statistical methods used in the article were examined by a professional biostatistician on the Sechenov Medical Journal editorial staff.

Conflict of interests. The authors declare that there is no conflict of interests.

Financial support. The study was not sponsored (own resources).